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1. Préparation des AEM
Remarque : Les MEA sont composés d’un substrat de verre, d’électrodes métalliques micro-fabriquées et d’une couche isolante en polymère SU-8. Aux fins de cette étude, des AEM disponibles dans le commerce ont été commandés avec une disposition personnalisée du réseau d’électrodes (figure 1 A et B). Les 68 électrodes sont disposées dans une grille rectangulaire qui est divisée en deux zones par une rainure de 300 μm de large exempte d’électrodes, de fils électriques et d’isolation. Chaque électrode mesure 40 x 40 m et est espacée de 200 m d’un centre à l’autre. Quatre grandes électrodes de terre sont positionnées autour du site d’enregistrement. Ils diffèrent des autres MEA standard disponibles dans le commerce par leur taille (21 mm x 21 mm) et ils n’ont pas de chambre d’enregistrement fixe.
- Pour la désinfection, rincez les AEM dans de l’éthanol à 100 % (2x), de l’éthanol à 70 % (1x) et de l’eau distillée (2x) pendant au moins 30 secondes chacun. Laisser sécher. Mettez 10 à 12 AEM dans une boîte de Pétri en verre propre (150 mm x 25 mm) et fermez le couvercle.
- Autoclave MEA pendant 20 min à 120 °C. Stocker chez RT.
- Préparez la solution de revêtement (voir liste des matériaux) pour les AEM et stockez les aliquotes à -20 °C.
- Placez chaque AEM dans une boîte de Pétri stérile individuelle (35 mm x 10 mm).
- À l’aide d’une pipette refroidie, placez une solution de revêtement réfrigérée de 150 μl sur les électrodes et fermez le couvercle de la boîte de Pétri. Après environ 10 minutes, vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air sur le dessus des électrodes et retirez-les délicatement avec une spatule recouverte de caoutchouc si nécessaire. Laisser reposer 1 h à température ambiante (RT).
- Aspirer les résidus de solution d’enrobage, laver 1x avec un milieu optimisé pour les neurones prénataux et embryonnaires et 2x avec de l’eau distillée et stérile. Si les AEM ne sont pas utilisés avant le lendemain, conservez-les dans de l’eau distillée et stérile à 37 °C dans l’incubateur pendant la nuit (H/N). Sinon, laissez sécher directement à RT.
2. Ingrédients nécessaires à la préparation et à la croissance des cultures organotypiques
- Préparez une solution de lavage sans calcium (voir la liste des matériaux).
- Reconstituez le plasma de poulet dans une solution de lavage (1:1, agitez doucement, évitez la formation de bulles), centrifugez à 3 000 x g pendant environ 20 minutes et décantez le contenu clair dans un tube stérile. Aliquote 200 μl dans des cryotubes et stockage à -20 °C.
- Reconstituer la thrombine à partir du plasma bovin en conséquence (200 U/ml) et du filtre stérile (filtre interstitiel de 0,2 μm). Aliquote 200 μl dans des tubes cristallins et stockage à -20 °C.
- Pour 30 cultures, préparez 100 ml de milieu nutritif (voir la liste des matériaux).
3. Dissection de tissu de la moelle épinière
Remarque : La procédure produit, en fonction du nombre d’embryons, des tranches de moelle épinière pour environ 25 à 35 co-cultures et est préparée à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Appliquer une dose létale de pentobarbital (0,4 ml) à l’animal mère par injection intramusculaire. Confirmez l’anesthésie profonde en vérifiant le réflexe de retrait de la pédale. Délivrance d’embryons de rats au jour 14 (E14) par césarienne et sacrifice par décapitation.
- Transférez les corps des embryons dans une boîte de Pétri remplie d’une solution de lavage stérile et réfrigérée.
- Effectuez une coupe transversale complète avec un scalpel au-dessus des membres postérieurs et une autre au-dessus des membres antérieurs et retirez les membres du corps. Ensuite, faites une incision dans le plan frontal pour séparer les viscères de la pièce dorsale contenant la moelle épinière.
- Pour le tranchage, transférez les pièces dorsales contenant la moelle épinière une à une sur un disque de montage et coupez à une épaisseur de 225 à 250 μm avec un hachoir à tissus. Déposez une goutte de solution de lavage sur le tissu haché et transférez les tranches à l’aide d’une spatule dans des boîtes de Pétri de 35 mm x 10 mm remplies d’une solution de lavage stérile et réfrigérée.
- Pour chaque tranche séparément, disséquez la moelle épinière loin du tissu restant. Laissez les ganglions de la racine dorsale attachés.
- Laissez reposer les tranches pendant 1 heure à 4 °C.
4. Montage de coupes de tissu de moelle épinière sur des AEM
- Réchauffer le milieu nutritif stérile dans l’incubateur (37 °C, couvercle légèrement dévissé pour l’oxygénation).
- Positionnez MEA à l’aide d’une pince à épiler stérile avec des pointes recouvertes de caoutchouc à RT dans la boîte de Pétri sous un stéréomicroscope avec le réseau d’électrodes au point. Centrez une gouttelette de 6 μl de plasma de poulet sur le réseau d’électrodes propre, sans poussière et stérile. À l’aide d’une petite spatule, glissez avec précaution deux sections de la moelle épinière avec les côtés ventraux face à face dans la gouttelette de plasma. Ne touchez pas les électrodes avec la spatule.
- Ajoutez 8 μl de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. À l’aide de l’embout de la pipette à thrombine, mélangez soigneusement et étalez le mélange de plasma de poulet/thrombine autour des deux tranches. Encore une fois, ne touchez pas directement le réseau d’électrodes cassant. Juste avant la coagulation, aspirez l’excès de plasma/thrombine de poulet.
- Fermez la boîte de Pétri pour qu’elle conserve un taux d’humidité élevé pendant que l’ensemble MEA/culture repose pendant environ 1 heure dans une chambre humidifiée à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C.
- Ajoutez délicatement 10 μl de milieu nutritif dans la chambre de culture, bouchez la boîte de Pétri et remettez-la dans l’incubateur pendant environ 30 min.
- Placez chaque ensemble MEA/culture avec des pointes stériles recouvertes de caoutchouc dans un tube roulant, ajoutez 3 ml de milieu nutritif et fermez bien le couvercle. Placez le tube du rouleau dans le tambour en tournant à 1 - 2 tr/min dans l’incubateur dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 à 37 °C.
- Changez la moitié du milieu nutritif après 7 jours in vitro (DIV) et ensuite 1 à 2 fois par semaine.
5. Lésions mécaniques
- Sortez l’ensemble MEA/culture avec des pointes stériles recouvertes de caoutchouc du tube roulant et placez-le dans une boîte de Pétri sans milieu nutritif sous un stéréomicroscope avec le tissu au point. Vérifiez visuellement que les deux tranches sont fusionnées.
- Maintenez l’ensemble MEA/culture stable en plaçant une pince à épiler avec des pointes recouvertes de caoutchouc sur le MEA.
- Placez une lame de scalpel dans la rainure du MEA près des tranches de tissu. Tenez le scalpel plutôt horizontalement.
- Soulevez le manche du scalpel, mais laissez la lame du scalpel rester dans la rainure du MEA de manière à ce que la lame « roule » de la base à la pointe et coupe ainsi le tissu recouvrant le sillon.
- Sévère toute connexion tissulaire résiduelle avec une pointe d’aiguille de 25 G si nécessaire. Ne travaillez que dans la zone à l’intérieur de la rainure et ne touchez pas les bords tendres.
- Remettez l’ensemble MEA/culture dans le tube du rouleau. Fournissez 3 ml de milieu nutritif frais aux cultures et remettez-les dans le tambour à rouleaux de l’incubateur.
6. Enregistrements électrophysiologiques de l’activité spontanée
- Pour étudier la régénération fonctionnelle entre les deux coupes de moelle épinière après le nombre choisi de DIV, montez l’ensemble MEA/culture dans une chambre d’enregistrement au microscope et appliquez environ 500 μl de solution extracellulaire (voir la liste des matériaux).
- Attendez 10 min avant le premier enregistrement pour permettre au système de se stabiliser.
- Enregistrez l’activité spontanée de base 2 fois pendant environ 10 minutes à partir de chaque électrode de détection d’activité de la MEA à RT.
- Pour garantir des conditions extracellulaires stables, échangez la solution extracellulaire après chaque session d’enregistrement.
