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Article de méthode

Génération d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites à l’aide de bioréacteurs à usage unique

1K vues

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8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

Source : Silva, T.P., et al. Génération évolutive d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunomarquage. J. vis. exp. (2020)

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à l’aide d’un bioréacteur 3D à usage unique. Le bioréacteur facilite la formation d’agrégats d’iPSC, qui sont ensuite traités avec une série de milieux de culture enrichis en facteurs de croissance et en chimiokines qui induisent la différenciation des agrégats d’iPSC en organoïdes cérébelleux matures. Par la suite, les organoïdes sont récoltés et cryoconservés pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Ensemencement des iPSC humaines dans le bioréacteur

  1. Incuber des iPSC cultivées sous forme de monocouches dans mTeSR1 complétées par 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 (ROCKi). Ajouter 1 mL de milieu supplémenté dans chaque puits à partir d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits et incuber pendant 1 h à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2,<br /> note: ROCKi est utilisé pour protéger les iPSC dissociées de l’apoptose.
  2. Après 1 h d’incubation, aspirer le milieu épuisé de chaque puits et laver 1x avec 1 mL de 1× PBS par puits.
  3. Ajouter 1 mL de milieu de décollement cellulaire (voir

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM15793 - 500mLTechniques des cellules souches
Concentré de lipides de définition chimique11905031ThermoFisher
BSA purifié par cristallisation 5470Sigma
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Sérum fœtal bovinA3840001ThermoFisher
Gélatine de peau de bovinG9391Sigma
Glutamax I10566-016ThermoFisher
AMPc de dibutyryle SC- 201567B -500mg Frilabo
F1221765029ThermoFisher
Ligne iPSC épisomale humaineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insuline91077CSigma
iPS DF6-9-9T. BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
Acide L-ascorbiqueA-92902Sigma
Matrigel354230Corningmatrice de membrane basale
MonothioglycérolM6154Sigma
mTeSR185850 -500mlTechnologies des cellules souches
Supplément N217502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldéhyde158127Sigma
PBS-0.1 Récipient à usage uniqueRéf. : IA-0.1-D-001PBS Biotech
Unité de base PBS-MINI MagDriveRÉF : IA-UNI-B-501PBS Biotech
BDNF humain recombinant450-02Peprotech
bFGF/FGF2 humain recombinant100-18BPeprotech
FGF19 humain recombinant100-32Peprotech
GDNF humain recombinant450-10Peprotech
SDF1300-28APeprotech
Inhibiteur de ROCKY-27632 72302Technologies des cellules souches
SB431542S4317Sigma
SaccharoseS7903Sigma
Composé Tissue-Tek O.C.T.25608-930VWR
de Ham humain recombinant

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