Génération d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites à l’aide de bioréacteurs à usage unique

Résumé

Source : Silva, T.P., et al. Génération évolutive d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunomarquage. J. vis. exp. (2020)

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à l’aide d’un bioréacteur 3D à usage unique. Le bioréacteur facilite la formation d’agrégats d’iPSC, qui sont ensuite traités avec une série de milieux de culture enrichis en facteurs de croissance et en chimiokines qui induisent la différenciation des agrégats d’iPSC en organoïdes cérébelleux matures. Par la suite, les organoïdes sont récoltés et cryoconservés pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Ensemencement des iPSC humaines dans le bioréacteur

1. Incuber des iPSC cultivées sous forme de monocouches dans mTeSR1 complétées par 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 (ROCKi). Ajouter 1 mL de milieu supplémenté dans chaque puits à partir d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits et incuber pendant 1 h à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO_2,<br /> note: ROCKi est utilisé pour protéger les iPSC dissociées de l’apoptose.
2. Après 1 h d’incubation, aspirer le milieu épuisé de chaque puits et laver 1x avec 1 mL de 1× PBS par puits.
3. Ajouter 1 mL de milieu de décollement cellulaire (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 7 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent facilement des puits en agitant doucement.
4. Pipetez le milieu de détachement cellulaire de haut en bas avec une micropipette P1000 jusqu’à ce que les cellules se détachent et se dissocient en cellules uniques. Ajoutez 2 ml de milieu de culture cellulaire complet dans chaque puits pour inactiver la digestion enzymatique et pipetez doucement les cellules dans un tube conique stérile.
5. Centrifuger à 210 × g pendant 3 min et retirer le surnageant.
6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture (c.-à-d. mTeSR1 complété par 10 μM de ROCKi) et compter les iPSC à l’aide d’un hémocytomètre à l’aide d’un colorant bleu trypan.
7. Amorcez 15 × 10⁶ cellules individuelles dans le bioréacteur (volume maximal de 100 ml) avec 60 ml de mTeSR1 complétés par 10 μM de ROCKi à une densité cellulaire finale de 250 000 cellules/ml.
8. Insérez le récipient contenant les iPSC dans l’unité de base universelle placée dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂,
   note: L’agitation du bioréacteur est maintenue pendant 24 h en réglant la commande universelle de l’unité de base sur 27 tr/min pour favoriser l’agrégation des iPSC.

2. Différenciation et maturation des agrégats humains dérivés d’iPSC dans les organoïdes cérébelleux

1. Définissez le jour de l’ensemencement de la cellule unique comme le jour 0.
2. Le jour 1, prélever 1 mL de l’échantillon d’agrégats iPSC à l’aide d’une pipette sérologique. Maintenez le bioréacteur sous agitation comme auparavant en plaçant l’unité de base universelle avec le bioréacteur contenant les agrégats dans un flux stérile avant de prélever l’échantillon. Plaquez la suspension cellulaire dans une plaque à 24 puits à fixation ultra-basse. Vérifiez que les agrégats dérivés d’iPSC sont formés.
3. Acquérez des images avec un microscope optique en utilisant un grossissement total de 40x ou 100x pour mesurer le diamètre global.
4. Mesurez la surface des agrégats dans chaque image à l’aide du logiciel FIJI.
   1. Sélectionnez « Analyser | Définir les mesures » dans la barre de menu et cliquez sur « Zone » et « OK ».
   2. Sélectionnez « Fichier | Ouvrir" dans la barre de menu pour ouvrir un fichier image stocké. Sélectionnez l’outil de sélection de ligne présenté dans la barre d’outils et créez une ligne droite sur la barre d’échelle présentée dans l’image. Sélectionnez « Analyser | Définir l’échelle" dans la barre de menus.
   3. Dans « Distance connue », ajoutez l'étendue de la barre d'échelle de l'image en μm. Définissez l'"Unité de longueur » en μm. Cliquez sur « Global » pour conserver les paramètres et « OK ». Sélectionnez Sélection ovale dans la barre d’outils.
   4. Pour chaque agrégat, délimitez la zone à l’aide de l’outil ovale. Sélectionnez « Analyser | Mesurer". Calculer leur diamètre en fonction de la surface mesurée, en considérant que les agrégats sont approximativement sphériques en utilisant
      Tableau 1 : Solutions mères et préparation des milieux. On y trouve la liste de tous les composants et volumes utilisés pour préparer les milieux pour le protocole de maintenance et de différenciation des iPSC, ainsi que les solutions mères de facteurs de croissance et de petites molécules. Pour les solutions mères, toutes les concentrations de matières premières et les protocoles de reconstitution sont énumérés.

      Préparation des supports	mTeSR1 Volume final : 500 mL	1. Décongeler mTeSR1 5× compléter à température ambiante (RT) ou à 4 °C pendant la nuit et mélanger avec du milieu basal 2. Conservez le milieu mTeSR1 complet à 4 °C jusqu’à 2 semaines ou préparez des aliquotes de 40 ml et conservez-les à -20 °C 3. Préchauffez mTeSR1 complet à RT avant utilisation
      	gfCDM (milieu chimiquement défini sans facteur de croissance) Volume final : 60 mL	30 mL Concentré lipidique chimiquement défini IMDM 30 mL (1 % v/v) 2,4 μL de monothioglycérol (450 μM) 30 μL d'apo-transferrine (solution mère à 30 mg/mL dans l'eau, concentration finale : 15 μg/mL) 300 mg BSA purifié par cristallisation (5 mg/mL) 42 μL d'insuline (concentration stockique à 10 mg/mL, concentration finale : 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 U/ml de pénicilline/50 μg/ml de streptomycine)
      	Neurobasal Volume final : 60 mL	60 mL de milieu neurobasal 600 μL de supplément N2 600 μL de Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v).
      	Complet BrainPhys Volume final : 60 mL	60 ml de BrainPhys 1,2 mL NeuroCult SM1 Supplément neuronal 600 μL Supplément N2 12 μL BDNF (concentration finale : 20 ng/mL) 12 μL GDNF (concentration finale : 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (concentration mère : 100 mg/mL dans l’eau, concentration finale : 1 mM) 42 μL d’acide ascorbique (concentration mère : 50 μg/mL dans l’eau, concentration finale : 200 nM)
      Solutions mères de facteurs de croissance et de petites molécules	Facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF/FGF2) Concentration de la matière : 100 μg/mL	1. Reconstituer dans 5 mM de Tris, pH 7,6, à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % de BSA dans du PBS (v/v) jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL
      	Facteur 1 dérivé des cellules stromales (SDF1) Concentration de la matière : 100 μg/mL	1. Reconstituer dans l’eau à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % de BSA (v/v) dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL.
      	Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) Concentration de la matière : 100 μg/mL<
      	Facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF) Concentration de la matière : 100 μg/mL
      	Facteur de croissance des fibroblastes 19 (FGF19) Concentration de la matière : 100 μg/mL	1. Reconstituer dans 5 mM de phosphate de sodium, pH 7,4, à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % de BSA dans du PBS (v/v) jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL
      	Inhibiteur de ROCK Y-27632 Concentration de la crosse : 10mM	Reconstituer dans le DMSO à une concentration de 10 mM.
      	SB431542 Concentration de la crosse : 10mM
      	Insulin Concentration de la pâte : 10 mg/mL	1. Reconstituer 10 mg d’insuline dans 300 μL de 10 mM de NaOH 2. Ajouter délicatement 1 M de NaOH jusqu’à ce que la solution devienne claire-transparente 3.Remplissez à 1 ml d’eau stérile

      Tableau 2 : Solutions pour la préparation d’organoïdes pour la cryosection et l’immunomarquage. Vous trouverez la liste de tous les composants et volumes utilisés pour préparer les solutions utilisées dans la préparation des organoïdes pour la cryosection et l’immunomarquage.

      Gélatine/Saccharose Concentration finale : 7,5 %/15 % p/p

      1. Pesez 15 g de saccharose et 7,5 g de gélatine dans une bouteille en verre Schott stérile et mélangez bien 2. Préchauffez le PBS 1× à 65 °C 3. Ajouter du PBS 1× préchauffé pour obtenir un poids final de 100 g et bien mélanger 4. Placez la bouteille en verre Schott dans une plaque chauffante à 65 °C et secouez-la jusqu’à ce que la gélatine fonde 5. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que la solution se stabilise

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1	5793 - 500mL	Techniques des cellules souches
Concentré de lipides de définition chimique	11905031	ThermoFisher
BSA purifié par cristallisation	5470	Sigma
DMEM-F12	32500-035	ThermoFisher
Sérum fœtal bovin	A3840001	ThermoFisher
Gélatine de peau de bovin	G9391	Sigma
Glutamax I	10566-016	ThermoFisher
AMPc de dibutyryle	SC- 201567B -500mg	Frilabo
F12	21765029	ThermoFisher
Ligne iPSC épisomale humaine	A18945	ThermoFisher	iPSC6.2
IMDM	12440046	ThermoFisher
Insuline	91077C	Sigma
iPS DF6-9-9T. B		WiCell
Iso-pentane	PHR1661-2ML	Sigma
Acide L-ascorbique	A-92902	Sigma
Matrigel	354230	Corning	matrice de membrane basale
Monothioglycérol	M6154	Sigma
mTeSR1	85850 -500ml	Technologies des cellules souches
Supplément N2	17502048	ThermoFisher
Neurobasal	12348017	ThermoFisher
Paraformaldéhyde	158127	Sigma
PBS-0.1 Récipient à usage unique	Réf. : IA-0.1-D-001	PBS Biotech
Unité de base PBS-MINI MagDrive	RÉF : IA-UNI-B-501	PBS Biotech
BDNF humain recombinant	450-02	Peprotech
bFGF/FGF2 humain recombinant	100-18B	Peprotech
FGF19 humain recombinant	100-32	Peprotech
GDNF humain recombinant	450-10	Peprotech
SDF1	300-28A	Peprotech
Inhibiteur de ROCK	Y-27632 72302	Technologies des cellules souches
SB431542	S4317	Sigma
Saccharose	S7903	Sigma
Composé Tissue-Tek O.C.T.	25608-930	VWR

de Ham humain recombinant