Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
Préparez une solution de mélange de média de centrifugation à densité dense en plaçant 90 ml de PBS 10x dans 264 ml d’eau désionisée ultrapure (3,93x) dans un récipient en plastique stérile. Titrer à un pH de 7,0-7,2 avec HCl et stériliser par filtre à travers un filtre de 0,22 μm. Conserver à 4 °C.
Préparez un milieu de centrifugation de 70 % en combinant 18 ml de solution de mélange de média de centrifugation de densité avec 30 ml de milieu de centrifugation de densité (voir la liste des matériaux pour plus de détails) dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 ml. Conserver à 4 °C, mais porter à RT avant utilisation.
Préparez un milieu de centrifugation de 37 % en combinant 9,6 ml de DPBS avec 10,4 ml de milieu de centrifugation de 70 % de densité dans un tube à centrifuger de 50 ml. Conserver à 4 °C, mais porter à RT avant utilisation.
1. Isolement des PBMC infiltrant le gliome
- À l’aide d’une lame de rasoir propre à un seul tranchant, isolez la zone du cerveau contenant la tumeur en faisant une coupe sagittale au centre du cerveau pour couper en deux les deux hémisphères. Retournez l’hémisphère ipsilatéral du côté médial vers le bas et effectuez deux coupes coronales au niveau du cervelet et du bulbe olfactif pour isoler le tissu cible contenant l’implant tumoral (Figure 1A). Une portion équivalente de l’hémisphère controlatéral peut également être isolée et utilisée comme témoin négatif.
- Placez le tissu cible dans le broyeur de tissus en verre Dounce contenant 1 ml de DPBS, poussez le piston à fond vers le bas et tournez-le 7 fois pour perturber initialement le tissu. Soulevez le piston pour permettre au liquide de se déposer au fond du broyeur de tissus. Répétez cette étape trois fois ; Cependant, ne tournez le piston que 4 fois lors des deux prochaines répétitions et 3 fois lors de la dernière répétition pour éviter de trop triturer le tissu.
- À l’aide d’une micropipette P-1000, appliquez séquentiellement trois volumes de 1 ml de DPBS glacé le long des côtés du piston pour rincer dans le broyeur de tissus.
- Remettez en suspension la matière cérébrale triturée en la pipetant de haut en bas et en la plaçant dans un tube à centrifuger de 15 ml étiqueté sur de la glace. Rincez les côtés du broyeur de tissus Dounce avec 1 ml supplémentaire de DPBS glacé et ajoutez-le dans le même tube de centrifugation de 15 ml. Conservez tous les tubes contenant de la matière cérébrale triturée sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités.
- Une fois que tous les échantillons ont été traités, faites tourner la matière cérébrale triturée dans les tubes à centrifuger de 15 ml à 740 x g (FCR max.) pendant 20 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml et d’un pistolet à pipette et remettre en suspension la matière cérébrale granulée dans 1 ml d’enzymes digestives collagénase/DNase-I préalablement préparées à l’aide d’un P-1000. Placez les tubes à centrifuger de 15 ml dans un support à éprouvette et placez-les dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min.
- Agitez doucement les échantillons deux fois tout au long de la période d’incubation en agitant les tubes pour faciliter la désagrégation des tissus.
- Ajouter 6 ml de DPBS glacé à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml dans chaque tube pour diluer les enzymes digestives. Pipetez de haut en bas pour les remettre en suspension et filtrez les volumes totaux à travers des filtres stériles en nylon de 70 μm dans de nouveaux tubes à centrifuger de 15 ml étiquetés sur de la glace.
- Faites tourner la suspension des cellules cérébrales à 740 x g (RCF max) pendant 20 min à 4 °C pour obtenir une pastille unicellulaire (Figure 1B). Après avoir retiré les tubes de 15 ml de la centrifugeuse, placez-les sur de la glace et augmentez la température de la centrifugeuse à environ 21 °C en préparation de l’étape suivante.
- Retirer complètement le surnageant de chaque tube contenant des cellules cérébrales et remettre les pastilles en suspension dans 1 ml de milieu de centrifugation à 70 % de densité à l’aide d’une micropipette P-1000. Ajoutez ensuite 4 millilitres supplémentaires de milieu de centrifugation à 70 % de densité dans chaque tube à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Vissez solidement les capuchons et homogénéisez la suspension des cellules en les inversant doucement vers les tubes à plusieurs reprises.
- Retirez les tubes à centrifuger de 15 ml contenant des cellules cérébrales remises en suspension dans un milieu de centrifugation à 70 % de densité de la glace et placez-les dans un support de tube à essai à RT. Un à la fois, superposer soigneusement 2 ml de solution de milieu de centrifugation à 37 % sur les 5 ml de milieu de centrifugation à 70 % à l’aide d’une micropipette P-1000 pour former une interface propre entre les deux couches de milieu de centrifugation de densité (Figure 1C).
- Utilisez un marqueur à pointe fine pour indiquer la position de l’interface afin qu’elle puisse être facilement identifiée après la centrifugation lorsque la distinction devient moins apparente.
- Faites tourner les tubes de centrifugation de 15 ml à 740 x g (FCR max.) pendant 20 min à RT sans interruption pour éviter de perturber l’interface.
- Après la centrifugation, récupérez les PBMC qui se sont accumulés à l’interface entre les deux couches de milieu de centrifugation de densité (Figure 1D) en introduisant une micropipette P-200 dans le tube le long de son côté, en contournant soigneusement la couche lipidique.
- Une fois au niveau de la bande PBMC, extrayez lentement 200 μl de la surface de la couche de média de centrifugation à 70 % de densité et placez-le dans un tube FACS en polypropylène étiqueté sur de la glace. Répéter l’opération une fois pour un volume total de 400 μl par échantillon.
- Ajouter 3 ml de tampon d’écoulement dans chaque tube FACS contenant 400 μl de PBMC pour diluer suffisamment le milieu de centrifugation de densité, puis faire tourner les cellules à 660 x g (RCF max) pendant 20 min à 4 °C.
