Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

Résumé

Source : Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant le gliome. J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo démontre l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant la tumeur à partir d’un cerveau de souris en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique. Ceci est suivi d’une centrifugation à gradient de densité pour collecter les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

Préparez une solution de mélange de média de centrifugation à densité dense en plaçant 90 ml de PBS 10x dans 264 ml d’eau désionisée ultrapure (3,93x) dans un récipient en plastique stérile. Titrer à un pH de 7,0-7,2 avec HCl et stériliser par filtre à travers un filtre de 0,22 μm. Conserver à 4 °C.

Préparez un milieu de centrifugation de 70 % en combinant 18 ml de solution de mélange de média de centrifugation de densité avec 30 ml de milieu de centrifugation de densité (voir la l....

Résultats

Figure 1 : Isolement des PBMC infiltrant le gliome. (A) Stratégie de dissection de tissu cérébral de souris contenant des implants de gliome orthotopique à un stade précoce. Le panneau supérieur montre la bisection sagittale de l’hémisphère ipsilatéral à l’opposé de l’hémisphère controlatéral. Le panneau inférieur montre les deux coupes coronales supplémentaires nécessaires po.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
La modification d'Eagles par Dulbecco Medium	Gibco	Référence 12430-054	Avec 4,5 g/L de D-glucose, L-glutamine, 25 mM d’HEPES et du rouge de phénol
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Gibco	Référence 14190 à 144	Sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium
Sérum fœtal bovin	Omega Scientific Inc.	FB-11
Pénicilline Streptomycine	Gibco	Référence 15140-122	10 000 μm/ml de pénicilline ; 10 000 μg/ml de streptomycine
Microtubes coniques en polypropylène de 0,6 ml	Genesee Scientific	22 à 272
Seau à glace en polyuréthane	Fisherbrand	Tél. : 02-591-45	Capacité : 0,152 oz (4,5 L)
Collagénase (type I-S)	Sigma Aldrich	Vers 1639	De Clostridium histolyticum
Désoxyribonucléase I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	2 000 > unités Kunitz par mg de poids sec
Ciseaux de dissection de grande taille	Ted Pella Inc.	1316
Ciseaux de dissection pour petits couteaux	Le	Référence 14094-11
Pince à extrémité arrondie	Ted Pella Inc.	Référence 13250
Broyeur de mouchoirs en papier Dounce en verre de 7 ml	Kontes	KT885300-0007
Média de centrifugation à densité Percoll	GE Soins de santé	GE17-0891-01
Pipettes sérologiques de 10 mL	Genesee Scientific	12 à 104	Usage unique ; stérile
Crépines à cellules en nylon stérile de 70 μm	Fisherbrand	22363548
Tubes à centrifuger en polypropylène de 15 ml	Genesee Scientific	21 à 103	Fond conique
Tubes à centrifuger en polypropylène de 50 ml	Genesee Scientific	21 à 108	Fond conique
Tubes FACS en polypropylène à fond rond de 12 x 75 mm	Fisherbrand	Référence : 14-956-1B