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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des instruments, des milieux de culture et des plats
- Préparez deux ciseaux de dissection de laboratoire en acier inoxydable et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclavez tous les instruments et placez-les dans une hotte de culture O/N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation.
- Préparer 500 ml de milieu de culture en milieu essentiel minimal (MEM) (10 % de sérum de veau fœtal, 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO3, 30 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 6 μg/ml d’ampicilline) et stériliser par filtre. Conserver à 4 °C pendant des mois.
- Préparez des plaques de culture à 24 puits contenant des lamelles de 14 mm d’épaisseur numéro 1. Autoclave les lamelles et enrobe de poly-d-lysine (PDL) 100 mg/L. La lumière UV stérilise O/N.
2. Préparation de solutions de culture de cellules granulaires cérébelleuses (CGC)
- Préparer la « solution A » (100 ml) dans un dH2O stérile autoclave, traité à la lumière UV, contenant 250 mg de glucose, 300 mg d'albumine sérique bovine [BSA], 955 mg de solution saline tamponnée au phosphate [PBS] (sans Ca2+ et Mg+) et 1 ml de 3,8 % de MgSO4·7H2O.
- Préparer la « solution B » (10 ml) contenant 1 ml de trypsine à 5 mg/ml diluée dans 9 ml de solution A.
- Préparer la « solution C » (10 ml) contenant 1 000 unités de DNase, 0,5 mg d'inhibiteur de trypsine de soja, 100 μl de MgSO4·7H2O à 3,8 %, diluée à 10 ml avec la solution A.
- Préparer la « solution D » (20 ml) contenant 3,2 ml de la solution C, diluée à 20 ml avec la solution A.
- Préparez une solution de solution saline équilibrée BSA/Earle's contenant de l'EBSS, 25 mM de NaHCO3, 3 mM de MgSO4·7H2O et 4 % de BSA, pH 7,4.
- Préparez l’ester méthylique de L-leucine (LME) en ajoutant du LME pur dans 5 ml de milieu de culture MEM pour obtenir une concentration finale de 150 mM de LME, ramenez la solution à un pH de 7,4 à l’aide d’un pH-mètre de paillasse et filtrez la stérilisation à l’aide d’un filtre à seringue en polyéther sulfone (PES) de 28 mm de 0,2 μm.
3. Culture des CGC
- Récupérez le cervelet de petits rats âgés de 4 à 7 jours. Placer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant 5 ml de solution A sur glace.
- Videz l’excès de solution du cervelet et placez le tissu dans le couvercle de la boîte de Pétri.
- Hachez finement le tissu avec une lame de rasoir bien flammée dans au moins trois directions différentes.
- Ajoutez du tissu haché à la solution B (rincez la boîte de Pétri avec une solution pour éviter une perte limitée de tissu) et placez-le dans le bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Agitez doucement toutes les deux minutes.
- Ajouter la solution D (20 ml) dans le tube pour neutraliser la trypsine, agiter et centrifuger à 65 x g pendant 5 min.
- Videz le surnageant.
- Remettre en suspension dans 4 ml de la solution C. Triturer bien (environ 10 fois chacune) avec trois pipettes en verre flammé de diamètre décroissant, jusqu’à ce que la suspension soit aussi homogène que possible.
- Ajoutez lentement et doucement quelques gouttes de cet homogénat sur le BSA/EBSS. S’il commence à couler à travers le BSA/EBSS, triturez davantage et/ou ajoutez un peu plus de solution C. L’homogénat doit reposer en une couche sur le dessus du BSA/EBSS. Ne pas secouer. Essorer à 100 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille (molle) dans 1 ml de milieu MEM.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’une plaque à 800 000 cellules/lamelle dans 500 μl de milieu MEM. Placer dans un incubateur à 37 °C avec 6 % de CO2.
- Changez le milieu le lendemain (24-36 heures après la préparation). Préparez une solution de milieu MEM contenant 10 μM de l’inhibiteur du cycle cellulaire arabinofuranosyl cytidine (AraC).
- Pour chaque lamelle, conservez 250 μl de l’ancien milieu dans une nouvelle plaque à 24 puits, aspirez le reste, ajoutez 250 μl de milieu MEM normal et aspirez-le pour laver les cellules. Ensuite, ajoutez les 250 μl de l’ancien milieu dans les cellules et complétez avec 250 μl de milieu contenant AraC.
note: Les cellules peuvent être utilisées à partir de 6 jours in vitro (DIV).
4. Épuisement sélectif de la microglie (effectué à 6 DIV)
- Ajouter du LME pur à 5 ml d’une aliquote séparée de milieu MEM pour obtenir une concentration finale de 150 mM de LME.
- Ramener la solution à un pH de 7,4 et stériliser par filtre à l’aide d’un filtre à seringue en polyéther sulfone (PES) de 28 mm de 0,2 μm.
- Diluer la solution à une concentration de 50 mM (2 x LME) dans un milieu MEM et la placer dans un bain-marie à 37 oC pendant 10 min avec un milieu MEM normal pour les cultures témoins.
- Retirer la moitié (250 μl) du milieu MEM des cultures CGC et conserver à 37 °C.
- Traiter les cellules avec un milieu MEM contenant 2 x LME (250 μl), c’est-à-dire dilué 1:1 donnant une bonne concentration de 25 mM, ou avec un milieu MEM préchauffé sans LME (250 μl) pour les cultures témoins.
- Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 6 % de CO2 pendant 1 heure.
- Laver les cellules deux fois dans un milieu MEM frais préchauffé pour éliminer les milieux contenant du LME, puis remplacer le milieu de culture conservé et un volume égal de milieu MEM frais préchauffé dans les puits correspondants.
- Remettre les cultures dans l’incubateur (humidifié avec 6 % de CO2 à 37 °C) et laisser reposer 24 heures avant tout traitement ultérieur.