Le protocole pour l’extraction de tissus cérébraux à partir du jour 1 des rateaux Sprague Dawley, euthanasiés par décapitation, a été approuvé par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Alberta.
1. Isolations de microglies et d’astrocytes
REMARQUE : Tous les milieux d’isolement et de culture cellulaire sont préchauffés à 37 °C au bain-marie. La solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contient 1 % de pénicilline-streptomycine (PS). Tous les milieux Eagle's modifiés de Dulbecco avec le mélange de nutriments F12 de Ham (DMEM/F12) sont complétés par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PS). Seuls les mélanges avec de la trypsine sont dépourvus de FBS. Tous les matériaux de ce protocole sont stériles (filtre, alcool, achetés et autoclavés) et chaque étape ultérieure à l’étape numéro 1.8 est effectuée dans une enceinte de biosécurité avec une technique aseptique.
- Par cerveau, préchauffer 15 mL de HBSS et 12,5 mL de DMEM/F12 à 37 °C dans des tubes à centrifuger coniques de 50 mL, et environ 2 mL de trypsine à 0,25 % avec 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube à centrifuger conique de 15 mL. Chauffer 25 ml de DMEM/F12 supplémentaires. Chauffer la trypsine environ 10 minutes avant l’utilisation pour éviter la perte d’activité enzymatique.
- Versez suffisamment de HBSS chaud dans des boîtes de culture stériles de 6 et 10 cm pour couvrir la surface. Préparez un plat de 10 cm pour deux cerveaux plus un plat supplémentaire de 6 cm.
- Placez jusqu’à 2 cerveaux dans chaque plat de10 cm (Figure 1A).
- Sous un microscope de dissection, utilisez des pinces courbes et droites pour séparer les cortex le long de la ligne médiane et le cervelet avec le tronc cérébral. Cela donne trois sections de tissu par cerveau (Figure 1B).
- Pelez la fine couche semi-transparente (méninges) de tissu contenant des vaisseaux sanguins de chaque section de tissu et jetez-la, en transférant le tissu restant dans une boîte de culture séparée. Saisissez les fines couches exposées par les coupures de tissus, à l'aide de la pince, et tirez avec précaution jusqu'à ce que les parties majeures « pendent » du tissu cérébral. Enfin, retirez cette portion en tirant doucement. Voir la figure 1C-1E pour des images représentatives d’avant, pendant et après cette étape.
- Dans une enceinte de biosécurité, retirez le HBSS restant de la boîte de culture, en conservant soigneusement le tissu. Faites macérer le tissu à l’aide d’un scalpel et transférez le tissu dans le tube de 15 ml préchauffé avec de la trypsine.
- Incuber ce tube pendant 25 min dans un bain à 37 °C pour digérer le tissu par voie enzymatique.
- Centrifugez le tube à 500 x g pendant 2 min à température ambiante et versez le surnageant.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajoutez 10 ml de DMEM/F12 chaud pour inactiver la trypsine et triturez la solution 5 fois pour briser le tissu.
- Centrifugez le tube à 500 x g pendant 2 min à température ambiante et versez le surnageant.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, remettre la pastille en suspension dans 10 ml de DMEM/F12 chaud et transférer la solution dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
- À l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de calibre 18, triturer la solution 3 fois.
- Répartissez cette solution par incréments de 12,5 ml de DMEM/F12 chaud par cerveau.
- Pipeter des incréments de 1 mL de la solution triturée dans une plaque à 12 puits (1 par cerveau).
- Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire humidifié. Remplacez le support au bout de trois jours et actualisez-le tous les trois jours suivants. Après 2 semaines, les cellules peuvent être collectées pour des expériences.
2. Synthèse des macromères
- Peser 375 mg de sel d’acide hyaluronique (HA) dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et ajouter 37,5 mL d’eau distillée.
- Rincez la solution avec un vortex pendant 1 min et sonicez le mélange jusqu’à ce qu’il apparaisse homogène et perde sa viscosité gélatineuse. Ce processus peut prendre 6 h.
- Transférer la solution dans un bécher de 100 mL à l’aide d’une barre d’agitation magnétique (38 mm) et agiter vigoureusement à température ambiante.
- Titrez soigneusement 5,0 M de NaOH dans l’AH de mélange et mesurez avec du papier pH jusqu’à ce que le pH se stabilise entre 8 et 12.
- Recueillir 3 ml d’anhydride méthacrylique frais (MA, 94 %), recouvert d’azote pendant l’entreposage.
note: MA est exposé à l’atmosphère pendant de longues durées (jours), il va perdre de sa réactivité.
prudence: Toute utilisation de MA doit se faire dans une hotte.
- Ajouter 200 μL de MA dans la solution de mélange HA. La réaction abaisse le pH de la solution en dessous de 8.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.6 jusqu’à ce que les 3 ml d’AM aient été ajoutés à la solution. Ce processus peut prendre jusqu’à 1 à 2 heures.
- Laisser la réaction se poursuivre toute la nuit à 4 °C, sans mélanger.
- Transférer la solution dans 400 mL d’éthanol froid (EtOH) dans un bécher de 500 mL et laisser précéder pendant 24 à 72 h à 4 °C.
- Décanter soigneusement la majeure partie de la solution dans un bécher séparé pour l’élimination et recueillir le précipité dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Celui-ci peut être distribué dans 2 à 4 tubes, si nécessaire.
- Centrifugez les tubes à 200 x g dans une centrifugeuse pendant 2 min à température ambiante et éliminez le surnageant.
- Remplissez le tube avec de l’EtOH froid, mélangez la solution avec un vortex pendant 1 minute et répétez les étapes 2.10-2.11.
- Ajouter 25 mL d’eau désionisée stérile, mélanger la solution avec un vortex pendant 1 min, du sonicate (>20 kHz) pendant 1 h et incuber à 4 °C pendant la nuit.
- Placez la solution dans un congélateur à -80 °C pendant 15 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit congelée ou congelée dans de l’azote liquide.
prudence: Lorsque vous utilisez de l’azote liquide, utilisez des gants de protection, un écran facial et un tablier.
- Lyophiliser le tube (en dessous de 0,1 mBar et -30 °C) pendant 24 à 48 h jusqu’à ce qu’une poudreuse semblable à de la neige se produise.
- À ce stade, testez la pureté de l’échantillon par résonance magnétique nucléaire 1H, où la quantité de protons méthacrylates (pics à 6,1 et 5,6 ppm), par rapport aux protons méthyliques (1,9 ppm), sur le squelette HA peut être confirmée. Un rapport minimum de 95 % de méthacrylate par rapport aux protons méthyles est acceptable.
3. Formation de gel et encapsulation 3D
- Préparation de la lamelle et du moule
- Préparez une solution d’eau distillée de 50 ml de méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl) propyle à 2 % dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
- Placez les lamelles en verre de 18 mm dans la solution et basculez pendant 1 h à température ambiante. Jusqu’à 50 lamelles peuvent être ajoutées à la fois.
- Rincer les lamelles en les trempant en série dans 3 béchers de 100 mL d’eau déminéralisée.
- Faites sécher les lamelles sous vide à 40 °C pendant la nuit avec un dessiccateur et un four.
- Immergez rapidement les lamelles individuelles dans 70 % d’EtOH à l’aide d’une pince.
- Sans sécher, déposer chaque lamelle dans un puits d’une plaque de 12 puits.
- Lavez et aspirez chaque puits avec de l’eau désionisée stérile (1 mL par puits).
- Ajouter 1 mL de poly-L-lysine (PLL) stérile à 2 μg/mL dans chaque puits et incuber pendant >2 h.
- Aspirez la solution PLL et laissez les lamelles sécher à l’air.
- Immergez les moules en polydiméthylsiloxane (PDMS) (voir Figure 2) dans de l’EtOH à 70 %, et placez-en un au centre de chaque lamelle, puis laissez sécher à l’air libre et créez un joint entre le moule et le verre.
- Préparez des moules PDMS en coulant des réactifs de prémélange PDMS dans un rapport de 10:1 dans une boîte en polystyrène à fond plat. La quantité de PDMS préparée est sélectionnée pour obtenir une feuille d’environ 1 mm d’épaisseur. Pour former des puits dans le PDMS, coupez les feuilles avec un poinçon circulaire d’un diamètre intérieur de 10.
- Préparation cellulaire
REMARQUE : Toutes les étapes du protocole sont effectuées avec une technique stérile dans une enceinte de biosécurité. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est ajustée à un pH de 7,4 pour toutes les étapes.
- 24 h avant l’encapsulation cellulaire dans de l’acide hyaluronique méthacrylé (HAMA), rafraîchir le milieu pour les cultures primaires de 2 semaines (à partir de l’étape 1.15) dans les plaques à 12 puits. Ajouter 1 mL de milieu DMEM/F12 (10 % FBS et 1 % PS) par puits.
- Pour chaque plaque de cellules à 12 puits, préparez 12,5 mL de trypsine diluée (0,25 % de trypsine-EDTA diluée à 30 % avec un milieu DMEM/F12), et 25 mL de DMEM/F12 (10 % de FBS et 1 % de PS) et réchauffez-la à 37 °C dans un bain-marie.
- Prélever le milieu conditionné des plaques à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL (> 0,5 mL par puits), aspirer complètement le liquide restant et le remplacer par 1 mL par puits de trypsine diluée (0,075 % de trypsine-éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) pendant 20 à 30 minutes dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2) jusqu’à ce que la couche cellulaire confluente se détache de la plaque.
- Récupérer le matériau des cellules en suspension à l’aide d’une pipette de 1 mL (sous la forme d’un seul morceau flottant) et le prélever dans un tube à centrifuger conique de 15 mL. Diluer avec un volume équivalent de DMEM/F12 (10 % FBS et 1 % PS), et centrifuger à 200 x g pendant 2 min à température ambiante, en jetant le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de DMEM/F12 chaud (10 % FBS et 1 % PS), triturer les cellules 5 fois avec une pipette de 10 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min.
- Décantez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 5 mL de DMEM/F12 chaud et transférez les cellules dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
- À l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de calibre 18, triturer la solution cellulaire 3 fois et filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube à centrifuger conique.
- Prélever 10 μL de suspension cellulaire, diluer 1:100 dans du DMEM/F12 chaud et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
- Incuber au bain-marie à 37 °C jusqu’à l’étape d’encapsulation.
- Encapsulation cellulaire
REMARQUE : Toutes les étapes du protocole sont effectuées avec une technique stérile dans une enceinte de biosécurité.
- Pour chaque plaque de 12 puits d’hydrogels 3D, réchauffer 12,5 mL de DMEM/F12 et 12,5 mL de milieux DMEM/F12 conditionnés recueillis lors de la préparation des cellules.
- Peser la quantité de HAMA requise pour une concentration finale de 0,5 % en poids/vol. Dissoudre ce HAMA dans du PBS filtré stérile à une concentration de (2 % en poids/vol) ; une concentration 4 fois supérieure à la concentration finale est utilisée pour permettre l’ajout de cellules et d’autres réactifs. Une plaque d’hydrogels à 12 puits nécessite ~350 μL de PBS avec 7 mg de HAMA.
- Sonicate (>20 kHz) jusqu’à ce que HAMA soit complètement dissous pendant 60 min.
- Préparez des solutions individuelles à 10 % de triéthanolamine (TEA) et de 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP), ainsi qu’une solution de 1 mM d’éosine Y (EY) dans 1 mL d’aliquotes de PBS stérile pH 7,4.
- Pour une plaque à 12 puits, faire un mélange final de 1,4 mL de 1 x 107 cellules, 0,5 % en poids/vol HAMA (350 μL à 2 % en poids/vol), 0,1 % de TEA (14 μL à 10 %), 0,1 % de NVP (14 μL à 10 %) et 0,01 mM EY (14 μL à 1 mM), et 20 % de mélange de lames basales (280 μL de stock). Le volume restant est PBS.
- Mélangez délicatement la solution et pipetez 100 μL dans chaque moule PDMS avec une pointe de 1 mL.
- Exposez les échantillons à une lumière LED verte de haute intensité (~520 nm, 60 mW, dans une boîte fermée de 20 cm x 20 cm x 20 cm) pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 1 mL par puits de DMEM/F12 conditionné à chaud dans une assiette à 12 puits.
- Saisissez chaque lamelle entre le pouce et l’index, décollez lentement le moule PDMS avec une pince à épiler incurvée en faisant attention de ne pas déplacer le gel et placez-le dans un puits avec un milieu conditionné.
- Ajouter 1 ml de DMEM/F12 chaud supplémentaire dans chaque puits.
- Incuber des plaques à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 semaines, en rafraîchissant les milieux cellulaires chaque semaine en pipetant 1 mL de milieu de chaque puits et en les remplaçant par 1 mL de DMEM/F12.
