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1. Culture cellulaire et préparation de réactifs
- Préparer des plaques revêtues pour la culture cellulaire.
- Diluer une solution de revêtement de matrice extracellulaire (ECM) avec un milieu DMEM/F12 pour préparer une solution mère à 1 mg/mL. Aliquote la solution mère diluée de MEC dans 30 tubes coniques de 3 mL chacun et stockez-le immédiatement à -20 °C. Pour une solution fonctionnelle, remettre en suspension 3 mL de stock ECM dans 33 mL de support DMEM/F12 pré-réfrigéré, ce qui porte le volume total à 36 mL pour une concentration de 80 μg/mL.
- Enduire 1 mL par puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec une solution de travail ECM. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 supplémentaire par puits (au besoin) pour s’assurer que la surface du puits est entièrement couverte. Laissez les plaques de culture cellulaire à 6 puits revêtues reposer à température ambiante pendant au moins 1 h avant de les utiliser.
REMARQUE : Les plaques revêtues peuvent être stockées dans l’incubateur ou à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparez des formulations de milieux, des facteurs de croissance et de petites molécules.
- Pour préparer 500 ml de milieu de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), ajoutez des suppléments 20x et 500x selon les instructions du fabricant.
- Pour préparer 500 ml de milieu neural (NM), ajoutez de l’héparine à une concentration finale de 2 mg/mL, 1 fois une solution d’antibiotique/antimycosique, 1 supplément de B27 ou 1 supplément de N2 à une bouteille de 500 ml de DMEM/F12 avec supplément de L-glutamine, comme indiqué précédemment.
- Pour préparer une solution mère de 10 mM (1 000x) d’inhibiteur de la rho-kinase Y27632 (Y), ajoutez 10 mg de poudre dans 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Filtrer, stériliser, aliquoter et stocker à -20 °C. Utiliser à une concentration de travail de 10 μM dans le milieu.
- Pour préparer une solution mère de 20 mM (10 000x) de SB431542, ajoutez 10 mg de poudre dans 1,3 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour préparer une solution mère de 2 mM (1 000x) de DMH1, ajoutez 10 mg de poudre dans 13,1 mL de DMSO. Filtrez, stérilisez, aliquote et conservez chaque solution à -20 °C. Utilisez-les à une concentration de travail de 2 μM dans le milieu (NM + SB431542 + DMH1).
note: Ce protocole recommande des concentrations de travail de 2 μM de SB431542 et de DMH1 sur la base de nos observations et de rapports d’autres personnes indiquant que cette concentration favorise efficacement l’induction neuronale des hPSC. Des concentrations plus élevées ont également été signalées30. De plus, avec des milieux alternatifs, il a également été démontré que les petites molécules ne sont pas nécessaires pour une conversion neuronale élevée. Ainsi, les concentrations de travail varieront en fonction des environnements de culture cellulaire alternatifs, et les concentrations optimales doivent être testées par des chercheurs individuels.
- Pour préparer des solutions mères individuelles de 100 μg/mL (10 000x) de facteur de croissance épidermique (EGF) et de facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF2), ajoutez 1 mg de chaque dans 10 mL de PBS + 0,1 % BSA. Des solutions mères aliquotes d’EGF et de FGF2 dans des aliquotes de 50 μL et stockées à -80 °C. Utiliser chacune à une concentration de travail de 10 ng/mL dans les milieux ; p. ex., ajoutez 5 μL d’EGF et 5 μL de FGF2 à 50 mL de NM (NM + EGF + FGF2).
- Pour préparer une solution mère de chlorhydrate de doxycycline (Dox), dissoudre d’abord la poudre dans du DMSO à 100 mg/mL et la conserver à -20 °C. De plus, le diluer pour obtenir une solution mère de 2 mg/mL (1 000x) dans du PBS et l’entreposer à -20 °C. Utiliser à une concentration de travail de 2 μg/mL dans les milieux ; p. ex., ajouter 50 μL de Dox à 50 mL de NM (NM + Dox).
note: Ne recongelez pas les solutions après la décongélation.
2. Génération de sous-types neuronaux à partir de cellules pluripotentes induites humaines (hPSC)
REMARQUE : Toutes les cultures cellulaires doivent être maintenues dans un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 °C. Ces cultures sont maintenues aux niveaux d’oxygène ambiants, bien que des niveaux plus faibles puissent être utilisés.
- Générer et gérer des progéniteurs d’astrocytes (hAstros) à partir de hPSCs.
note: Cette section fournit un protocole de différenciation bref et simplifié. Pour une description détaillée (avec la formation du corps embryoïde, la sélection de la rosette et les étapes de structuration régionale), reportez-vous au protocole décrit précédemment (Figure 1A, encadré vert pointillé).
- Implantez des grappes de CSPh (figure 1B) sur des plaques à 6 puits recouvertes d’ECM (voir l’étape 1.1) avec 2 mL de milieu CSPh + Y par puits. Nourrissez les cellules souches tous les jours jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 50 % et divisez-les au besoin.
- Pour diviser les hPSC, ajoutez 1 mL de réactif de passage dans les puits et aspirez après 1 min. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min, ajouter 1 mL de milieu hPSC et répartir les agrégats 1:10 dans de nouveaux puits recouverts d’ECM dans 2 mL de milieu hPSC + Y par puits.
- Maintenez les cellules souches jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 50 %, puis changez de milieu en NM + SB431542 + DMH1 pour induire la différenciation neurale (jour 0). Lorsque les cellules sont confluentes à environ 95 %, divisez-les 1:6 en nouveaux puits recouverts d’ECM dans le même milieu.
- Au jour 14, dissocier les cellules avec la solution de détachement et les transférer dans une fiole non enrobée avec du Y pour favoriser la formation d’agrégats.
note: L’ajout de Y est utilisé pour favoriser la survie cellulaire et la formation de sphères, mais n’est pas inclus lors de chaque repas.
- Pour la génération de progéniteurs neuronaux et de neurones (hNeurones), utilisez ces cellules jour-14 comme décrit ci-dessous. Alternativement, utilisez ces cellules à des moments ultérieurs à partir de cultures monocouches ou sphériques avant que la maturation neuronale ne se produise ou que la gliogenèse ne commence.
note: Par défaut, ce protocole produit des astrocytes dorsal-corticaux. Cependant, les sous-types d’astrocytes peuvent être spécifiés régionalement par l’ajout de morphogènes de motifs si vous le souhaitez. L’acide rétinoïque (RA) peut être ajouté pour caudaliser les cellules en phénotypes de la moelle épinière, tandis que le hérisson sonique (SHH), l’agoniste lissé (SAG) ou la purmorphamine produiront des phénotypes ventraux.
- Pour la génération de progéniteurs d’astrocytes et d’astrocytes dans des agrégats 3D formés spontanément (hAstrospheres), passez à NM + EGF + FGF2 et nourrissez chaque semaine (ou au besoin pour assurer un pH stable) comme indiqué précédemment.
- Dissociez doucement les agrégats hAstro avec une solution de détachement lorsque des centres sombres apparaissent et supprimez les sphères qui s’attachent spontanément. Cassez doucement les sphères une fois par semaine pour maintenir la santé des sphères et éviter les noyaux nécrotiques.
note: Ne pas dépasser 5 min de traitement avec solution de décollement.
- Après 4 à 6 mois d'expansion, confirmer l'identité cellulaire et la congeler dans un milieu de cryoconservation (selon les instructions du fabricant) ou dans d'autres conditions de stockage pour une conservation à long terme dans de l'azote liquide ou l'utiliser immédiatement à des fins expérimentales.
