Génération de sphères de co-culture 3D d’astrocytes et de neurones pour induire la formation de synapses

Résumé

Source : Cvetkovic, C., et al. Modélisation de microcircuits synaptiques avec cocultures 3D d’astrocytes et de neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre une procédure de co-culture des astrocytes et des neurones pour former des sphères 3D. Ces sphères 3D fournissent une plate-forme distincte pour l’examen de la formation des synapses et de l’intégration des réseaux neuronaux, servant ainsi de modèle potentiel pour la recherche en neurosciences du développement, en maladies neurodégénératives et en interventions neuropharmacologiques.

Protocole

1. Préparation et maintenance des cocultures de sphères 3D

1. Dissociez les hAstros des agrégats 3D en suspension.​
   1. Dissociez doucement les agrégats d’astrocytes humains (hAstro) avec une solution de détachement lorsque des centres sombres apparaissent et supprimez les sphères qui s’attachent spontanément. Cassez doucement les sphères une fois par semaine pour maintenir la santé des sphères et éviter les noyaux nécrotiques.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 5 min de traitement avec la solution de décollement.
2. Dissociez les hNeurons ou les iNeurones d’une monocouche 2D.
   1. Retirer le milieu de la plaque à 6 puits et ajouter 500 μL de solution de détachement à chaque culture monocouche contenant bien de hNeuron (neurone humain) ou d’iNeurons (neurones inductibles). Incuber à 37 °C pendant 5 min. Ajouter délicatement 2 à 3 ml de milieu basal DMEM/F12 pour éliminer les cellules attachées.
   2. Prélever les cellules et les milieux dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 1 min. Aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu frais et pipeter doucement de haut en bas avec une micropipette de 1 000 μL pour obtenir une suspension unicellulaire.
3. Formez des sphères 3D à l’aide de plaques de culture de micropuits.
   1. Préparez la plaque en ajoutant 0,5 mL de solution de rinçage anti-adhérence dans chaque puits de la plaque du micropuits. Plaque de centrifugation à 2 000 x g pendant 5 min. Aspirez la solution de rinçage, ajoutez 1 mL de milieu basal DMEM/F12 dans chaque puits à laver et aspirez à nouveau.
      note: Assurez-vous toujours que la centrifugeuse est équilibrée pendant l’utilisation.
   2. Comptez chaque type de cellule à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Ajouter le rapport désiré de hAstros et de hNeurones dissociés ou d’iNeurones à chaque puits dans un volume total de 2 ml de milieu neuronal (NM) + Y (inclure Dox si des iNeurones sont utilisés). Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 3 min et retourner dans l’incubateur.
      REMARQUE : Les plaques de micropuits à 24 puits (voir le tableau des matériaux) contiennent 300 micropuits par puits. Ajouter un minimum de 6 x 10⁵ cellules (pour les sphères de 2 x 10^{3 cellules} chacune) et un maximum de 6 x 10⁶ cellules (pour les sphères de 2 x 10^{4 cellules} chacune) dans 2 mL de milieu par puits. Pour des sphères viables d’une densité spécifique dans cette plage, utilisez une quantité définie de cellules et divisez-la par 300 pour calculer le nombre de cellules par sphère. D’autres méthodes et outils de formation de sphères peuvent également être utilisés si vous le souhaitez. Suivez les instructions du fabricant pour connaître les plages acceptables de densités cellulaires.
   3. Laisser les cellules s’auto-assembler en sphères densément tassées à l’intérieur de plaques de micropuits au cours des 2 prochains jours (figure 1A). Remplacez 50 % du milieu si la culture jaunit
      note: Ne remplacez que la moitié du support et pipetez doucement lors du retrait et de l’ajout du support afin de ne pas déranger les sphères. Les sphères peuvent se soulever des micropuits et fusionner avec une force plus élevée.
   4. Après 2 jours, retirer délicatement les sphères des micropuits à l’aide d’une micropipette de 1 000 μL (figure 2D). Appliquez légèrement une force sur le fond des micropuits avec un support pour enlever toute sphère collée supplémentaire. Laissez les sphères se déposer dans un tube conique de 15 ml, aspirez l’ancien support et ajoutez-y un nouveau support.
4. Installez le système de bioréacteur à fiole tournante pour former des sphères 3D.​
   1. Nettoyez la surface d’une plaque d’agitation magnétique avec de l’éthanol à 70 % et placez-la dans un incubateur de culture cellulaire. Autoclave des flacons individuels à stériliser.
   2. Ajouter des sphères d’un minimum de 50 à 60 ml de milieu dans chaque fiole tournante (figure 2D, encadré). Placez la fiole sur la plaque d’agitation magnétique réglée à 60 tr/min. Cultivez les sphères dans des flacons tournants jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la collecte de données.
      note: Un minimum de 3 semaines en culture est nécessaire pour la formation des synapses.

Résultats

Figure 1 : Génération systématique et reproductible de sphères neuronales 3D bio-ingénierie. (A) Les plaques de culture Microwell (μ-well) sont utilisées pour former des sphères neuronales 3D de densité souhaitée et de rapports neurones/astrocytes de manière systématique et spécifiée par l’utilisateur, ce qui permet d’obtenir une taille et une forme constantes. Les images sont...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 6 puits	Fisher Scientific	Référence 08-772-1B
Tubes coniques de 15 ml	Olympus Plastics	28 à 101
Accutase	sigma	A6964-100ML	Solution de détachement
Plaque AggreWell	Technologies des cellules souches	Référence 34850
Solution de rinçage anti-adhérence	Technologies des cellules souches	N° 7010	Empêcher l’adhérence des cellules aux plaques de micropuits
Anti/anti	Thermopêcheur	15240062
B27	Thermopêcheur	17504044	Supplément médias
Milieu neuronal BrainPhys	Technologies des cellules souches	Référence 5790	Alternative neurophysiologique au milieu basal
DMEM/F12	Thermopêcheur	Référence 10565-042	Avec supplément GlutaMAX
DMH-1	Technologies des cellules souches	Référence 73634	DANGER : Toxique en cas d’ingestion. Concentration de travail : 2 uM
Sérum d’âne	Laboratoires biologiques de Lampire	Référence 7332100	Concentration de travail : 5 % dans le tampon de blocage primaire, 1 % dans le tampon de blocage secondaire
Chlorhydrate de doxycycline (Dox)	sigma	D3072-1ml	DANGER : Toxique pour les femmes enceintes. Concentration de travail : 2 μg/mL
Facteur de croissance épidermique (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentration de travail : 10 ng/mL
Facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF)	Peprotech	100 à 18 milliards	Concentration de travail : 10 ng/mL
Hémacytomètre ou compteur automatique de cellules	Technologies de la vie	AMQAX1000
Matrice membranaire Matrigel	Corning	Référence 354230	Solution de revêtement ECM. Concentration de travail : 80 ug/ml. Préparez-le sur de la glace et assurez-vous que les pipettes, les tubes et les supports sont pré-refroidis.
Système MEA 2100	Systèmes multicanaux	MEA2100
Inhibiteur de la rho-kinase Y27632- (Y)	Tocris	1254	Concentration de travail : 10 uM
SB431542	Technologies des cellules souches	Référence 72234	Concentration de travail : 2 uM
Fioles tournantes	Fisher Scientific	4500-125
Fiole de culture T25	Olympus Plastics	25 à 207	Casquettes ventilées
Trypan bleu	Invitrogen	Réf. T10282