Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des cultures de MSC de rats
- Prélèvement de CSM dans le fémur
- Autoclavez tous les outils de dissection (c’est-à-dire les ciseaux de dissection fine, les ciseaux de coupe à pointe émoussée et les pinces dentées) à 180 °C pendant au moins 2 h avant utilisation.
- Préparer un milieu de croissance MSC composé d’un milieu essentiel minimal - modification alpha (αMEM) complété par 15 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de pénicilline/streptomycine (P/S, 1 % v/v).
- Sacrifier de jeunes rats Sprague Dawley mâles (200-250 g de poids corporel) par surdosage de pentobarbital (240 mg/kg de poids corporel, intrapéritonéale).
note: Les échantillons de moelle osseuse de différents rats doivent être traités séparément.
- Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen et leurs membres inférieurs avec de l’éthanol à 70 %.
- Retirez la peau et le tissu sous-cutané sur la partie interne des cuisses à l’aide de ciseaux à dissection fine et d’une pince. Retirez les muscles de la cuisse sur la circonférence jusqu’à ce que le fémur soit exposé. Continuez ainsi en proximal et en distal jusqu’à ce que les articulations du genou et de la hanche soient visibles. Désarticuler le fémur par l’articulation de la hanche et du genou à l’aide de ciseaux coupants à bout émoussé.
note: Ne transectez pas le fémur pour exposer la cavité de la moelle à ce stade. Transférez les fémurs intacts dans une hotte de culture de tissus à flux laminaire pour un traitement ultérieur.
- Utilisez des ciseaux à pointe émoussée pour transecter les extrémités distales et proximales du fémur à travers la métaphyse.
- Placez une crépine à cellules de 70 μm sur un tube conique de 50 mL. Insérez une seringue de 21 g de 10 ml contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) dans le canal fémoral exposé et rincez le contenu de la moelle dans le tube conique par rinçage répété.
note: Environ 20 ml de PBS sont utilisés pour rincer chaque fémur. Si la couleur du contenu rincé reste tachée de sang et trouble, un volume plus important peut être utilisé.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 480 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de croissance MSC. Déposer les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm. Placez les boîtes de culture tissulaire dans un incubateur cellulaire (37 °C, 5 % CO2). Enregistrer le premier jour de placage comme jour 0.
note: Dans toutes les étapes de centrifugation, réglez le frein pour une décélération maximale.
- Etablissement et expansion des colonies MSC
note: Ce protocole repose sur l’adhérence du plastique de culture tissulaire à certaines CSM à l’intérieur de la cavité médullaire. Le contenu de la moelle osseuse est laissé adhérer au plastique de culture tissulaire pendant 2 jours.
- Le jour 2, rincez trois fois les plaques de culture avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Remplacez le PBS par 10 ml de milieu de croissance MSC après le rinçage. Lavez les cellules avec du PBS et remplissez-les de milieu de croissance MSC tous les 3 jours.
note: Les colonies de CSM devraient être visibles aux jours 6 et 7 (figure 1A).
- Passez les cellules au jour 10 en retirant le milieu de croissance et en rinçant les cellules avec du PBS. Ajouter 1,5 mL de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 3 mL de milieu de croissance MSC pour neutraliser la réaction. Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 x g pendant 5 min.
- Quantifier les cellules à l’intérieur de la pastille à l’aide d’un hémocytomètre après une dilution appropriée dans le PBS.
- Les graines ont fait passer des cellules à une densité de 40 000 cellules/cm2 dans une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
note: Les CSM de rats devraient atteindre une confluence de 80 à 90 % dans les 2 jours suivant leur passage (figure 1B). Les cellules peuvent être traversées comme décrit à l’étape 1.2.2 pour un maximum de 8 passages. Les CSM peuvent être caractérisées à l’aide de l’immunocytochimie et de leur capacité de différenciation trilinéaire (Figure 2). Seules les cultures de CSM entre les passages 3 et 8 sont soumises à un préconditionnement hypoxique ultérieur et à un enrichissement neural des progéniteurs. Les CSM dont le nombre de passages est le plus élevé adoptent une morphologie aplatie (Figure 1C) et ne produisent pas suffisamment de progéniteurs neuraux. Ces cultures devraient être jetées.
2. Préparation des cultures humaines BMSC
- Diluer 1 mL d’aspiration de moelle osseuse humaine avec 9 mL de milieu de croissance MSC et déposer les cellules sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm. Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire (37 °C, 5 % CO2).
- Retirez le milieu après 2 jours et rincez doucement les cultures trois fois avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Après le rinçage final, retirez le PBS et remplacez-le par 10 ml de milieu de croissance MSC. Reconstituer le milieu de culture tous les 3 jours après le rinçage PBS.
note: Les colonies de MSC devraient être visibles au jour 6-7. Le nombre de colonies peut varier d’un sujet à l’autre.
- Passez les cellules le jour 10, comme décrit à l’étape 1.2.2. Quantifier les cellules à l’intérieur de la pastille à l’aide d’un hémocytomètre après une dilution appropriée dans le PBS. Ensemencer les cellules passées à une densité de 40 000 cellules/cm2 sur une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
note: Les CSM humaines (figure 1D) présentent une morphologie similaire à celle des CSM de rats et devraient atteindre une confluence de 80 à 90 % dans les 2 jours suivant leur passage. Ils doivent être caractérisés par immunocytochimie et leur capacité de différenciation trilinéaire. Comme pour les CSM de rats, les CSM humaines entre les passages 3 et 8 sont soumises à un préconditionnement hypoxique ultérieur et à un enrichissement neural des progéniteurs.
3. Préconditionnement hypoxique
- Démontez les composants de la chambre d’hypoxie (c’est-à-dire la base, le couvercle, les plateaux) après avoir relâché la pince à anneau et nettoyez les pièces individuelles avec de l’éthanol à 70 %. Placez les composants de la chambre dans un capot de culture de tissus à flux laminaire pour une stérilisation à la lumière UV pendant 15 min.
- Avant le préconditionnement hypoxique, retirer le milieu et rincer les cultures de CSM chez le rat et chez l’homme (sections 1 et 2) avec 10 ml de PBS. Remplacer le PBS par 10 mL de milieu de croissance MSC complété par 25 mM de HEPES.
note: Les CSM cultivées sur des boîtes de 10 cm doivent avoir atteint une confluence de 80 à 90 % avant d’être soumises à un préconditionnement hypoxique.
- Placez les boîtes de culture dans la chambre d’hypoxie. Remontez les composants de la chambre et serrez la bague de serrage. Injecter un mélange gazeux à 99 % N2/1 % O2 dans la chambre à un débit de 10 L/min pendant 5 min.
- Scellez les extrémités de connexion de la chambre d’hypoxie pour éviter toute fuite de gaz. Placez la chambre à l’intérieur de l’incubateur cellulaire (37 °C, 5 % CO2) pendant 16 h.
- Une fois le préconditionnement hypoxique terminé, retirez les cultures de la chambre en préparation de la culture ultérieure d’enrichissement des progéniteurs neuraux.
4. Culture d’enrichissement des progéniteurs neuronaux
- Préparez un milieu progéniteur neural composé du milieu d'aigle modifié de Dulbecco et du mélange nutritif F12 de Ham (DMEM/F12) complété par de la vitamine B27 (2 % v/v), du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF, 20 ng/mL), du facteur de croissance épidermique (EGF, 20 ng/mL) et du P/S (1 % v/v).
- Détacher les CSM hypoxiques préconditionnées rat/humain, comme décrit à l’étape 1.2.2. Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 x g pendant 5 min. Quantifier les cellules à l’intérieur de la pastille à l’aide d’un hémocytomètre après dilution appropriée dans le PBS.
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu progéniteur neural et les ensemencer sur des plaques à 6 puits à faible fixation à une densité de 6 000 cellules/cm2. Placez la culture dans un incubateur cellulaire (37 °C, 5 % CO2) pendant 12 jours. Reconstituer 75 % du milieu progéniteur neural tous les 3 jours.
note: Des amas de cellules non adhérentes de grande taille doivent être observés aux jours 6 et 7. Entre le 10e et le 12e jour, des neurosphères d’un diamètre ≥ 100 μm peuvent être observées (Figure 3). Les CSM préconditionnées en hypoxie devraient produire plus de neurosphères que les CSM cultivées dans des conditions normoxiques.
- Prélevez les neurosphères le 12e jour en les aspirant dans une pipette de 10 ml et en les transférant dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les neurosphères à 250 x g pendant 5 min
note: Les neurosphères peuvent être caractérisées au 12e jour pour les marqueurs progéniteurs neuraux, tels que la nestine et le GFAP.
5. Génération de cellules semblables aux cellules de Schwann
- Préparez un milieu d’induction gliale composé d’αMEM complété par de la β-Heregulin (100 ng/mL), du bFGF (10 ng/ml), du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA, 5 ng/mL), du FBS (10 %) et du P/S (1 % v/v).
- Plaquez les neurosphères préparées dans la section 4 dans des plaques à 6 puits recouvertes de PDL/laminine à une densité de 5 à 10 sphères parcm2 dans 1,5 mL de milieu d’induction gliale par puits. Remplacez le milieu d’induction gliale tous les 2 jours après avoir rincé les cellules avec PBS.
note: On voit les cellules des neurosphères ensemencées migrer vers l’extérieur au jour 2. Au 7e jour, les cellules migratrices ont un aspect effilé et devraient démontrer une immunopositivité pour les marqueurs cellulaires de Schwann p75, le récepteur de la neurotrophine (p75) et S100β. Ces cellules sont appelées SCLC.
