Génération de cellules de Schwann engagées dans le destin par coculture avec des neurones DRG
1. Préparation des neurones DRG purifiés du rat
- Autoclavez tous les outils de dissection (c’est-à-dire les ciseaux de dissection, les pinces, les pinces à deux microdissections et les ciseaux de microdissection) à 180 °C pendant au moins 2 h avant de les utiliser.
- Enduire les plaques de culture tissulaire à 6 puits de poly-D-lysine (PDL, 10 μg/mL dans du PBS) à 4 °C pendant la nuit. Retirez le PDL et rincez avec 1,5 m de PBS par puits.
- Procéder à l’enrobage des plaques avec de la laminine (10 μg/mL dans du PBS) à 37 °C pendant 2 h. Rincer les plaques avec 1,5 mL de PBS par puits.
- Préparez le milieu de maintenance des neurones DRG, composé d’un milieu neurobasal complété par de la B27 (2 % v/v), de la L-glutamine (1 % v/v), du facteur de croissance nerveuse (NGF, 20 ng/mL) et de la pénicilline/streptomycine (P/S, 1 % v/v).
- Préparez le milieu de purification des neurones DRG, composé d’un milieu neurobasal complété par de la B27 (2 % v/v), de la L-glutamine (1 %), du facteur de croissance nerveuse (NGF, 20 ng/mL), DU P/S (1 %), de la fluorodésoxyuridine (FDU, 10 μg/mL) et de l’uridine (10 μg/mL).
- Sacrifier les rates gravides aux 14e et 15e jours de gestation par surdosage de pentobarbital (240 mg/kg de poids vif, intrapéritonéale).
- Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
- Coupez la paroi abdominale inférieure de l’animal longitudinalement à l’aide de ciseaux à dissection fine et de pinces. Identifiez et retirez l’utérus à l’aide de ciseaux de dissection. Coupez la paroi utérine pour exposer et extraire les embryons. Transférez les embryons dans une boîte de culture stérile de 10 cm remplie de PBS. Placez le plat de culture sur de la glace.
- Transférez l’embryon destiné à la dissection dans une boîte de culture stérile de 10 cm remplie de PBS (température ambiante) et placez-le sous un microscope de dissection. Avoir l’embryon en position couchée.
note: La moelle épinière blanchâtre et les DRG attachés peuvent être vus sur la face dorsale de l’embryon, à travers sa peau translucide.
- Insérez une pince de microdissection de chaque côté de la moelle épinière et utilisez la dissection émoussée pour commencer à séparer la moelle épinière des tissus mous environnants. Coupez la moelle épinière de l’animal à l’aide d’une pince de microdissection le long de l’ouverture du cou et du bout de la queue. Effectuez une dissection contondante supplémentaire sur la face ventrale du cordon pour le libérer des tissus mous environnants.
- À l’aide d’une pince de microdissection, vous pouvez retirer les tissus mous résiduels sur la face dorsale de la moelle épinière libérée.
note: À ce stade, il ne reste que la moelle épinière, les racines nerveuses et le DRG attaché.
- Détachez les DRG individuels de leurs racines nerveuses de connexion à l’aide d’une pince de microdissection. À l’aide d’un stylo-pipette fixé à une pointe de 1 ml, transférez les DRG dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml contenant PBS.
note: Pour chaque tube de 1,5 ml, un maximum de 100 DRG peuvent être logés.
- Centrifuger les DRG à 250 x g pendant 5 min et les remettre en suspension dans un réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant (200 μL par tube). Incuber (37 °C, 5 % CO2) pendant 10 min. Centrifugez les DRG à 250 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettez-les en suspension dans le milieu de maintenance des neurones DRG. Dissocier la pastille par trituration douce à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. Quantifier les cellules à l’intérieur de la pastille à l’aide d’un hémocytomètre après une dilution appropriée.
- Ensemencez les cellules à une densité de 5 000 cellules/cm2 dans des plaques à 6 puits recouvertes de PDL/laminine dans 1,5 mL de milieu de maintenance des neurones DRG par puits. Après deux jours de culture, retirez le milieu de maintenance des neurones DRG, rincez-le avec du PBS et remplacez-le par un milieu de purification des neurones DRG.
note: Pour chaque cycle de purification, traiter les cultures DRG avec un milieu de purification pendant 2 jours, suivis d'1 jour d’incubation dans un milieu d’entretien. Après 3-4 cycles de purification, l’élimination de toutes les cellules gliales endogènes est attendue. Cela devrait prendre environ 14 jours. Les cultures purifiées sont positives pour le marqueur neuronal TUJ1 et sont absentes pour l’expression de S100β (Figure 1).
2. Génération de cellules de type cellules de Schwann
- Préparez un milieu d’induction gliale composé d’αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), modifications alpha) complété par de la β-Heregulin (100 ng/mL), du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF, 10 ng/ml), du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA, 5 ng/mL), du sérum fœtal bovin (FBS, 10 %) et du P/S (1 % v/v).
- Plaquez les neurosphères préparées à la section 4 dans des plaques à 6 puits recouvertes de PDL/laminine à une densité de 5 à 10 sphères par cm2 dans 1,5 mL de milieu d’induction gliale par puits. Remplacez le milieu d’induction gliale tous les 2 jours après avoir rincé les cellules avec du PBS.
- REMARQUE : Les cellules des neurosphères ensemencées migrent vers l’extérieur au jour 2. Au 7e jour, les cellules migratrices ont un aspect effilé et devraient démontrer une immunopositivité pour les marqueurs cellulaires de Schwann p75 récepteur de la neurotrophine (p75) et S100β7. Ces cellules sont appelées SCLC.
3. Coculture de SCLC avec des neurones DRG
- Préparez un milieu de coculture composé d’un milieu de maintenance des neurones DRG (étape 1.1.4) et d’un milieu d’induction gliale (étape 1.2.1) dans un rapport volume-volume de 1:1.
- Préparez un milieu d'entretien pour cellules Schwann composé du milieu Eagle modifié et du mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco, complété par du FBS (5 %), de la β-Heregulin (10 ng/mL) et du P/S (1 % v/v).
- Retirer le milieu de culture des CPPC du jour 7, les rincer avec du PBS et les incuber avec 0,5 ml/puits de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant à 37 °C pendant 5 min. Remettre les CPPC en suspension dans le milieu de coculture.
- Quantifier les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après une dilution appropriée.
- Ensemencez les SCLC dans des cultures de neurones DRG purifiées à une densité de 1 000 cellules/cm2. Maintenez les cocultures pendant 14 jours, avec remplacement du milieu tous les 2 jours.
note: Au cours de la coculture, les CPPC ont acquis la morphologie fusiforme typique des cellules de Schwann matures (figure 2). Ces cellules persistent dans leur phénotype après le retrait des facteurs de croissance et sont capables de myéliniser les axones in vitro et in vivo. La positivité des marqueurs des cellules de Schwann (c’est-à-dire p75 et S100β) doit être surveillée par immunofluorescence.
- À la fin de la coculture, le passage des cellules de Schwann engagées. Utilisez 0,5 mL de réactif de dissociation par puits. Quantifier les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après une dilution appropriée.
