Une méthode in vitro pour générer des échafaudages d’astrocytes dans des micro-colonnes d’hydrogel

Résumé

Source : Katiyar, K. S., et al. Réseaux d’astrocytes alignés tridimensionnels conçus pour récapituler les mécanismes de développement et faciliter la régénération du système nerveux. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre une méthode pour générer des échafaudages d’astrocytes tridimensionnels dans des micro-colonnes d’hydrogel. L’intérieur des microcolonnes est recouvert de collagène. Des astrocytes sont introduits, qui adhèrent au collagène et, avec une incubation supplémentaire, s’auto-assemblent en un échafaudage tridimensionnel.

Protocole

1. Développement des micro-colonnes d’hydrogel d’agarose

1. Préparez une solution d'agarose à 3 % poids/volume (p/v) en pesant 3 g d'agarose et en la transférant dans un bécher stérile contenant 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Ajoutez une barre magnétique stérile dans le bécher et placez-la sur la surface d’une plaque chauffante/d’un agitateur. Gardez le bécher couvert pour éviter l’évaporation de son contenu à l’étape suivante.
2. Chauffez l’agarose et le DPBS à une température de 100 °C et remuez à 60-120 tr/min. Ajustez ces paramètres si nécessaire et surveillez constamment la progression du processus de dissolution à mesure que la solution passe initialement d’un aspect opaque à un aspect clair qui signifie que l’agarose a été complètement dissoute.
   prudence: Le bécher chaud et la solution sont chauds !
3. Pendant que la solution d’agarose est chauffée et agitée, récupérez quatre boîtes de Pétri vides de 10 cm et ajoutez 20 ml de DPBS à deux d’entre elles. Placez des aiguilles d’acupuncture (diamètre : 300 μm, longueur : 40 mm), des tubes capillaires en verre d’un microlitre (diamètre : 701,04 μm, longueur : 65 mm, capacité : 25,0 μL) et un distributeur de bulbes à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Lorsque la solution d’agarose liquide s’évacue, maintenez un chauffage constant à environ 50 °C et agitez pour éviter la gélification de l’agarose.
4. Introduisez une aiguille d’acupuncture dans l’ouverture inférieure d’un distributeur de bulbe. Insérez un tube capillaire sur l’aiguille exposée à l’extérieur. Fixez le tube capillaire en introduisant une partie de celui-ci dans la section en caoutchouc du cylindre du distributeur de bulbes.
5. Transférez 1 mL d’agarose liquide à l’aide d’une micropipette à la surface d’une boîte de Pétri vide et placez une extrémité du tube capillaire verticalement (avec l’aiguille insérée) en contact avec l’agarose, pendant que le capuchon en caoutchouc du distributeur de bulbe est pincé vers l’intérieur. Relâchez lentement la pression sur le capuchon du distributeur de poire pour aspirer l’agarose dans le tube capillaire.
   note: Le transfert de l’agarose liquide dans les tubes capillaires doit être effectué rapidement. Si l’agarose liquide est laissée refroidir à la surface de la boîte de Pétri pendant un temps suffisant (environ 60 s), elle commence à gélifier, empêchant une aspiration appropriée de l’agarose le long du tube capillaire.
6. Placez chaque ensemble bulbe-tube-aiguille dans une boîte de Pétri libre et laissez le gel d’agarose à l’intérieur des tubes capillaires se solidifier pendant 5 min. Retirez délicatement le tube capillaire avec vos mains du bouchon en caoutchouc dans le cylindre du distributeur de bulbe, en laissant l’aiguille et le gel d’agarose en place à l’intérieur du tube.
7. Extrayez manuellement l’aiguille d’acupuncture en la retirant lentement du tube capillaire ; le cylindre d’agarose nouvellement solidifié glisse également hors du tube dans cette procédure, entourant toujours l’aiguille. Poussez doucement la micro-colonne le long de l’aiguille d’acupuncture avec la pointe d’une pince stérile pour la déplacer jusqu’à la fin. Placez l’aiguille sur une boîte de Pétri ouverte contenant du DPBS et enfoncez la micro-colonne dans le DPBS à l’aide d’une pince
   note: Si la micro-colonne d’agarose reste à l’intérieur du tube capillaire en verre lors du retrait de l’aiguille d’acupuncture, poussez lentement la micro-colonne d’agarose hors du tube capillaire avec une aiguille de calibre 25 mm et dans la boîte avec DPBS.
8. Stérilisez les microscalpels ou les pinces à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Préparez de l’agarose à 4 % p/v en pesant 4 g d’agarose et en le transférant dans 100 mL de DPBS. Chauffer et remuer comme expliqué à l’étape 1.2 pour obtenir une solution d’agarose liquide claire à 4 %. Maintenez le chauffage et l’agitation de la solution tout au long des étapes suivantes.
9. Transférez les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes dans une hotte de dissection, et déplacez une micro-colonne avec une pince fine dans une boîte de Pétri vide. Utilisez le stéréoscope pour le guidage visuel et un microscalpel pour couper les micro-colonnes à la longueur souhaitée. Coupez les deux extrémités pour former des extrémités biseautées à des angles de 45^o par rapport à l’horizontale pour faciliter la manipulation des micro-colonnes lors de l’ajout de matrice extracellulaire (ECM) et de cellules.
10. Répétez l’étape précédente pour trois autres micro-colonnes dans la même boîte de Pétri et alignez les quatre constructions en parallèle avec une séparation de <3 mm entre chacun des cylindres. Chargez 50 μL de solution d’agarose à 4 % à l’aide d’une micropipette et versez une traînée/ligne de liquide sur le réseau de micro-colonnes pour connecter et regrouper les constructions en groupes de quatre (ci-après appelés « bateaux à micro-colonnes »). Évitez de déplacer 4 % d’agarose vers les extrémités des micro-colonnes, ce qui pourrait obstruer l’intérieur, en minimisant la distance entre les constructions et en ajoutant rapidement l’agarose en une fine ligne.
    note: Il n’est pas nécessaire d’agencer des groupes de quatre micro-colonnes en « bateaux » pour fabriquer les échafaudages astrocytaires. Néanmoins, les bateaux servent à accélérer le processus de fabrication et à offrir un moyen plus sûr de déplacer et de manipuler des micro-colonnes dans les étapes ultérieures.
11. Laissez refroidir le bateau à micro-colonne pendant 1 à 2 minutes pour permettre la gélification de l’agarose ajouté à 4 %. Saisissez le bateau à micro-colonnes à l’aide d’une pince fine à l’aide de l’agarose à 4 % qui le relie, et déplacez les micro-colonnes vers l’autre boîte de Pétri contenant du DPBS préparée à l’étape 1.1.3. Fabriquez plus de bateaux avec les micro-colonnes restantes comme vous le souhaitez.
12. Déplacez les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes et/ou les bateaux dans une enceinte de biosécurité et stérilisez-les en les exposant à la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min
    prudence: Portez une protection appropriée pour éviter l’exposition aux UV.
13. Conservez les plats avec les nacelles à micro-colonnes dans DPBS à 4 °C, si l’ajout d’ECM et le placage cellulaire n’ont pas lieu immédiatement après, jusqu’à 1 semaine. Répétez les étapes de fabrication des micro-colonnes si les constructions ne sont pas utilisées pendant cette période.

2. Culture et isolement de cellules primaires

1. Isolement des astrocytes corticaux chez les petits rats
   1. En prévision des étapes suivantes, ajoutez 20 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans quatre boîtes de Pétri de 10 cm qui serviront de réservoirs pour les tissus disséqués. Gardez toute la vaisselle sur de la glace. Stérilisez des ciseaux chirurgicaux, des pinces, une microspatule et des micro-scalpels propres dans un stérilisateur à billes chaudes.
   2. Préchauffer la trypsine à 0,25 % avec 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,15 mg/mL de désoxyribonucléase (DNase) I dans HBSS à 37 °C. De plus, préchauffez le milieu de culture d'astrocytes à 37 °C, qui se compose du milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco avec le mélange de nutriments F-12 de Ham et 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).
   3. Anesthésier les ratons Sprague-Dawley du jour 0 ou du jour 1 postnatals en les exposant à des conditions d’hypothermie et euthanasier par décapitation. Épinglez la tête dans une étagée à l’aide d’une aiguille de calibre 19 mm placée dans le museau avant les yeux.
   4. Faites une incision avec un scalpel au milieu de l’arrière vers l’avant, de la base du cou jusqu’à juste derrière les yeux. Effectuez une autre incision latérale en partant directement de l’arrière des yeux vers le bas, en formant une forme en T. À l’aide d’une pince fine, tirez la peau du crâne ou le crâne sur le côté.
   5. Tenez la tête par le museau (vers le haut) en plaçant une broche de la pince dans la gueule de l’animal et l’autre sur la surface extérieure. Retirez le cerveau à l’aide d’une micro-spatule stérile et placez-le dans l’une des boîtes de Pétri remplies de HBSS réfrigéré. Placez cette boîte de Pétri sur de la glace immédiatement après et à tout moment sauf lors de l’utilisation.
   6. Situez un bloc de granit préalablement stocké à -20 °C sous un stéréoscope à l’intérieur d’une hotte de dissection. Placez la boîte de Pétri avec le tissu cérébral à la surface du bloc de granit pour préserver sa basse température pendant la procédure de dissection. Utilisez le stéréoscope comme guide visuel tout au long des étapes suivantes.
   7. Si les bulbes olfactifs restent intacts, extrayez-les en les coupant à l’aide d’une pince ou d’un microscalpel. De plus, utilisez un microscalpel pour retirer le cervelet et faire une incision médiane séparant les deux hémisphères cérébraux. Transférez les hémisphères à l’aide d’une pince dans une boîte de Pétri contenant du HBSS frais et réfrigéré.
   8. Disséquez les structures du mésencéphale de l’intérieur des hémisphères à l’aide d’un microscalpel pour obtenir uniquement les cortex séparés. À l’aide d’une pince fine, on décolle les méninges, une structure en forme de feuille, du tissu cortical et on transfère les cortex isolés dans une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS froide. Utilisez le microscalpel pour hacher le tissu afin d’augmenter la surface d’action de la trypsine à l’étape suivante.
   9. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les cortex dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de trypsine-EDTA préchauffée (8 cortices dans chaque tube). Exposez le tissu cortical à la trypsine-EDTA pendant 5 à 7 minutes à 37 °C.
   10. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirer délicatement la trypsine-EDTA et ajouter 400 μl de solution d’ADN I à 0,15 mg/mL dans le tube à centrifuger. Agitez le tube ou le vortex jusqu’à ce que tous les tissus soient dissociés et qu’il n’y ait plus de morceaux de tissu restants dans le liquide. S’il n’est pas possible de dissoudre complètement le tissu, prélever les fragments restants à l’aide de la pointe d’une pipette Pasteur.
   11. Centrifuger le tube contenant la solution cellulaire dissociée à 200 x g pendant 3 min. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur sans déranger les cellules. Ajouter 1 mL de milieu de culture d’astrocytes (défini à l’étape 2.1.2) dans le tube à l’aide d’une micropipette et agiter pour remettre en suspension et créer une solution homogène.
   12. Transvaser 10 mL de milieu de culture d’astrocytes à l’aide d’une pipette sérologique dans une fiole T-75. Ajouter 250 μl de la solution cellulaire de 1 mL (préparée à l’étape 2.1.11) à l’aide d’une micropipette dans la fiole pour plaquer une coquille de cervelle de petit par fiole. Répartissez uniformément la solution cellulaire évacuée sur le milieu de culture et agitez doucement le ballon pour favoriser une distribution uniforme.
   13. Cultivez les flacons plaqués dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂. Après avoir atteint 24 et 72 h en culture, agitez mécaniquement le ballon pour détacher les types de cellules non adhérentes, tels que les neurones et les oligodendrocytes.
   14. Ensuite, à chacun de ces points de temps, effectuez un changement de média. Tenez le ballon verticalement de sorte que le milieu de culture repose au fond du ballon et ne recouvre pas les cellules collées. Aspirez le milieu de culture à l’aide d’une pipette Pasteur en appuyant l’extrémité de la pipette contre le coin inférieur de la fiole pour éviter d’extraire les cellules. Placez le ballon dans sa position horizontale d’origine et ajoutez délicatement 10 ml de milieu astrocytaire sur les cellules à l’aide d’une pipette sérologique.
   15. Remettez les flacons dans l’incubateur après chaque changement de milieu. Une fois que la confluence de 90 % est atteinte, agitez à nouveau mécaniquement le ballon pour éliminer les cellules non adhérentes restantes.
   16. Passage des astrocytes en prélevant le milieu de culture à l’aide d’un vide et d’une pipette Pasteur. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % à l’aide d’une pipette sérologique sur les cellules collées. Agitez doucement le ballon pour vous assurer que la trypsine recouvre toutes les cellules, et incubez le ballon pendant 5 à 7 minutes à 37 °C et 5 % de CO₂.
   17. Tremper la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu astrocytaire dans les cellules à l’aide d’une pipette sérologique. Extraire la solution cellulaire du ballon à l’aide d’une pipette sérologique et la transférer dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 3 min.
   18. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique et le remettre en suspension dans 1 mL de milieu de culture d’astrocytes. Agitez le tube pour vous assurer que la solution cellulaire est homogène. Comptez le nombre de cellules dans la solution à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
       note: Un flacon confluent à 90 % produit généralement environ 3 millions d’astrocytes.
   19. Ajouter 10 ml de milieu de culture d’astrocytes dans une fiole T-75. Effectuer une dilution de 1:4 en transférant 250 μl de la solution cellulaire (étape 2.1.18) à l’aide d’une micropipette dans la fiole T-75 contenant déjà du milieu de culture. Agitez doucement pour assurer une répartition homogène des cellules sur toute la surface du ballon.
   20. Répétez les étapes 2.1.16 à 2.1.19 chaque fois que 90 % de confluence est atteint pour passer les cellules.
2. Isolement des neurones corticaux chez les fœtus de rat
   1. Suivre des préparations similaires aux étapes 2.1.1 et 2.1.2, à l’exception du milieu préchauffé qui est un milieu de co-culture, composé d’un milieu neurobasal + 2 % de supplément de B-27 (pour les neurones) + 1 % de supplément sans sérum G-5 (pour les astrocytes) + 0,25 % de L-glutamine.
   2. Euthanasier des rats Sprague-Dawley du 18e jour avec asphyxie au dioxyde de carbone et confirmer la mort par décapitation.
   3. Extrayez les fœtus de rat et disséquez les cortex du reste du tissu cérébral dans des boîtes de Pétri contenant du HBSS à la surface du bloc de granit refroidi, à l’aide d’un stéréoscope pour le guidage visuel et de ciseaux stérilisés, d’un microscalpel et d’une pince. Après la dissection successive des têtes, des cerveaux, des hémisphères cérébraux et des cortex, transférez chaque tissu dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS.
   4. Hachez le tissu cortical en fragments plus petits pour augmenter la surface de la trypsine. Transférez 4 à 6 cortex à l’aide d’une pipette Pasteur dans un tube contenant 5 mL de trypsine-EDTA préchauffée et maintenez-le à 37 °C pour dissocier le tissu. À 5-7 min, agitez manuellement le tube pour mélanger et éviter l’agglutination des tissus.
   5. Retirez le tube à 37 °C après 10 min. Comme expliqué précédemment à l’étape 2.1, extraire la trypsine-EDTA et la remplacer par 1,8 mL de solution d’ADN à 0,15 mg/mL. Ensuite, agitez le tissu jusqu’à ce que la solution apparaisse homogène, sans fragments de tissu flottant dans le liquide.
   6. Centrifuger la solution de tissu dissocié à 200 x g pendant 3 min. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension dans 2 mL de milieu de coculture. Comptez le nombre de cellules dans cette solution à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
      note: Le rendement habituel est de 3,0-5,0 x 10⁶ cellules/hémisphère cortical.
   7. Préparer une nouvelle solution cellulaire d’une densité de 2,0 à 4,0 x 10⁵ cellules/mL dans le milieu de coculture défini ci-dessus.

3. Développement des câbles astrocytaires à l’intérieur des micro-colonnes

1. Fabrication du noyau ECM
   REMARQUE : L’ECM doit être ajouté à l’intérieur des micro-colonnes d’hydrogel le jour même où l’ensemencement des cellules sera effectué.
   1. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, préparer une solution de 1 mg/mL de collagène de type I en milieu de co-culture dans un tube de microcentrifugation stérile. Maintenez le tube de microcentrifugation avec la solution ECM sur de la glace en tout temps, sauf en cas d’utilisation.
   2. Transférez 1 à 2 μL de la solution ECM à l’aide d’une micropipette sur une bande de papier tournesol pour estimer son pH. Ajoutez 1 μL d’hydroxyde de sodium (NaOH) 1 N ou d’acide chlorhydrique (HCl) à l’aide d’une micropipette pour augmenter ou diminuer le pH de la solution ECM, respectivement, et pipetez vers le haut et vers le bas pour homogénéiser. Vérifiez le nouveau pH à l’aide d’une bande de papier tournesol et ajoutez plus d’acide ou de base, au besoin, jusqu’à ce que le pH soit stable dans la plage de 7,2 à 7,4.
   3. Déplacez les boîtes de Pétri de l’étape 1.2 vers une hotte de dissection, et transférez 4 à 5 micro-colonnes ou un bateau avec une pince fine stérile dans une boîte de Pétri vide et stérile de 35 ou 60 mm. À l’aide du stéréoscope comme guide, placez la pointe de 10 μL d’une micropipette à une extrémité de chaque micro-colonne et aspirez pour vider la lumière du DPBS et des bulles d’air. Confirmez l’absence de bulles d’air à l’aide du stéréoscope pour vous assurer que l’ECM ajouté à l’étape suivante peut circuler librement sur la lumière.
   4. Chargez une micropipette P10 avec une solution ECM, placez l’embout de 10 μL contre une extrémité des micro-colonnes d’hydrogel et délivrez suffisamment de solution pour remplir la lumière (environ 3-5 μL), en observant l’entrée de l’ECM avec le stéréoscope. Pipeter un petit réservoir (2-4 μL) de solution ECM à chaque extrémité de la micro-colonne.
      note: Gérez toujours 4 à 5 micro-colonnes ou un bateau à la fois pour éviter un dessèchement prolongé des constructions, car cela pourrait entraîner le froissement de la structure de la micro-colonne. Des micro-colonnes complètement séchées se fixent fermement à la surface des boîtes de Pétri, ce qui empêche leur utilisation pour l’ensemencement cellulaire. Il n’est pas possible d’ajouter des quantités excessives de milieux de coculture (comme mesure d’hydratation) aux microcolonnes, car cela pourrait entraîner l’écoulement de la MEC pendant la période d’incubation décrite ci-dessous.
   5. Pipeter le milieu de co-culture dans un anneau autour de la boîte de Pétri pour fournir un puits d’humidité afin d’éviter que les colonnes ne se dessèchent pendant l’incubation. Incuber la boîte de Pétri contenant les micro-colonnes contenant l’ECM à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 h pour favoriser la polymérisation du collagène avant d’ajouter les neurones et/ou les astrocytes.
      note: L’ECM doit former une couche recouvrant la surface interne de la lumière creuse, plutôt qu’un noyau ECM solide englobant l’intérieur, les deux pouvant être observés à l’aide du stéréoscope. Si l’ECM forme un noyau, continuez la période d’incubation jusqu’à ce qu’il ne reste plus que la couche. Une fois cette couche formée, la solution de cellules astrocytaires peut remplir l’intérieur de la micro-colonne dans les étapes de placage.
   6. Pendant la période d’incubation, préparez la solution de cellules d’astrocytes (comme décrit ci-dessous).
2. Ensemencement d’astrocytes et de neurones dans les micro-colonnes
   1. Passage des astrocytes plaqués (entre le quatrième et le douzième passage) comme expliqué dans les étapes 2.1.16-2.1.19. Après avoir compté le nombre de cellules dans le ballon, préparer une solution cellulaire à une densité de 9,0-12,0 x 10 solution à⁵ cellules/mL en suspension dans un milieu de culture cellulaire.
   2. À l’aide d’un stéréoscope, placez l’extrémité d’une micropipette P10 à l’une des extrémités des micro-colonnes et transférez suffisamment de solution cellulaire (~5 μL) dans la lumière pour la remplir complètement. Comme fait ci-dessus avec l’ECM, ajoutez de petits réservoirs de solution cellulaire aux deux extrémités de chaque micro-colonne.
   3. Incuber les micro-colonnes plaquées sur les boîtes de Pétri à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 h pour favoriser la fixation des astrocytes à l’ECM. Si les neurones ne sont pas ajoutés aux micro-colonnes, passez à l’étape 3.2.5.
   4. Après la période d’incubation initiale, ajouter 1 à 2 μL de la solution de neurones corticaux obtenue à l’étape 2.2.7 aux deux extrémités des micro-colonnes à l’aide d’une micropipette, tout en observant sous le stéréoscope. S’assurer qu’il y a suffisamment de milieu dans les plats pour éviter le dessèchement, et incuber à nouveau pendant 40 min à 37 °C et 5 % de CO₂ pour permettre l’adhésion des neurones.
      note: Une solution de neurones corticaux peut également être ajoutée 1 à 2 jours après la formation du faisceau, en effectuant l’étape 3.2.4 après avoir soigneusement retiré le milieu de culture de la boîte de Pétri à l’aide d’une micropipette.
   5. Après la période d’incubation, remplissez soigneusement les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes plaquées avec 3 ou 6 ml de milieu de co-culture pour des boîtes de Pétri de 35 ou 60 mm, respectivement. Maintenez les micro-colonnes plaquées en culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pour favoriser l’auto-assemblage des faisceaux astrocytaires alignés, qui devraient former une structure en forme de câble après 6 à 10 h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguille d’acupuncture (300 μm de diamètre)	Lhassa Medical	HS.30x40	Le diamètre peut varier en fonction de la taille souhaitée pour la lumière de la micro-colonne.
Pétri	pêcheur	Référence 08772B
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Pipette sérologique jetable en polystyrène	pêcheur	13-678-11D
Agarose	sigma	A9539-50G
Tube capillaire en verre d’un microlitre (701 μm)	pêcheur	21 à 170J	Le diamètre peut être modifié en fonction de la taille souhaitée pour la coque de la micro-colonne.
Distributeur d’ampoules à micro-bouchons	pêcheur	21 à 170J	L’ampoule est livrée avec les tubes à microcap.
plaque chauffante	pêcheur	SP88857200
Barre magnétique	pêcheur	1451352
Micropipette	sigma	Z683884-1EA
Aiguille de calibre 25 mm	pêcheur	Tél. : 14 826-49
Microscalpel	Roboz Chirurgical	RS-6270
ciseaux	Outils scientifiques fins	Référence 14081-09
forceps	Instruments de précision mondiaux	501985
Stérilisateur à billes chaudes	sigma	Z378550-1EA
stéréoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatule	pêcheur	Réf. S50821
Collagène de queue de rat de type I	Corning	354236	Maintenir à 4 ºC et ne retirer qu’en cas de besoin. Utilisez de la glace pour préserver sa température lors de l’utilisation.
Tube de microcentrifugation	pêcheur	Tél. : 02-681-256
Hydroxyde de sodium (NaOH)	pêcheur	SS2661
Acide chlorhydrique (HCl)	pêcheur	SA48-1
papier de tournesol	pêcheur	Tél. : 09-876-18
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Conserver à 4 ºC.
0,25 % Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056	Conserver à -20 ºC et réchauffer à 37 ºC avant utilisation.
Désoxyribonucléase pancréatique bovine (Dnase) I	sigma	10104159001	Conserver à -20 ºC et réchauffer à 37 ºC avant utilisation.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) avec mélange de nutriments F-12 de Ham	Gibco	Référence 11330-032	Conserver à 4 ºC.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Produits biologiques d’Atlanta	S11195	Conserver à -20ºC.
Postnatal jour 0 ou jour 1 : petits rats Sprague Dawley	Rivière Charles	Souche 001
Neurone embryonnaire neurobasal milieu basal	Invitrogen	21103049	Conserver à 4 °C et réchauffer à 37 °C avant utilisation.
Supplément sans sérum B-27	Invitrogen	12587010	Conserver à -20 ºC et réchauffer à 37 ºC avant utilisation.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Conserver à -20 ºC et réchauffer à 37 ºC avant utilisation.
Supplément astrocytaire G5	Invitrogen	17503012
Rats embryonnaires Sprague Dawley jour 18	Rivière Charles	Souche 001
Pipette Pasteur	pêcheur	Référence 22-042816
Tube à centrifuger de 15 mL	EMESCO	Référence 1194-352099
tourbillon	pêcheur	Tél. : 02-215-414
centrifugeuse	pêcheur	Tél. : 05-413-115
Hémocytomètre	pêcheur	Référence 02-671-6
incubateur	pêcheur	Tél. : 13 998 076