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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de l’échafaudage en soie
- Préparation de la solution de soie à partir de cocons de Bombyx mori
- Coupez chaque cocon en 8 morceaux égaux à l’aide de ciseaux. Utilisez environ 11 cocons pour 5 g de cocons fragmentés. (15 min)
- Préparez 2 L de solution de CO3 0,02 M Na2et faites-la bouillir à l’aide d’une plaque chauffante. (15 min)
- Pesez 5 g de cocons fragmentés et faites-les bouillir dans une solution de Na2CO3 pendant 30 min. Remuez la soie bouillante toutes les deux minutes avec une spatule. Cette étape, appelée dégommage, purifie la fibroïne de soie à partir de protéines hydrophiles, les séricines. (30 minutes)
- Essorez la fibroïne à la main et rincez-la au moins trois fois à l’eau distillée pour éliminer la séricine et les produits chimiques restants. (5 min)
- Placez la fibroïne humide sur une boîte de Pétri et séchez l’extrait de fibroïne dans la hotte d’écoulement O/N.
- Le lendemain, pesez la masse de fibroïne sèche et placez-la dans un bécher en verre. (15 min)
- Pour dissoudre la fibroïne dans une solution de LiBr à 9,3 M, calculez le volume requis (en ml) de LiBr en multipliant la masse de fibroïne sèche par 4. Versez lentement la solution LiBr sur la fibroïne de soie et utilisez une spatule pour immerger toutes les fibres de fibroïne. Couvrez le bécher pour éviter l’évaporation et placez-le à 60 °C pendant 4 heures pour permettre aux fibres de se dissoudre. (15 min)
- À l’aide de la seringue, prélevez la solution de fibroïne dans le bécher et chargez-la dans les cassettes de dialyse MWCO 3 500. Effectuer une dialyse à l’eau distillée pendant 48 heures. Changez l’eau toutes les deux heures.
- À l’aide de la seringue, prélever la solution de fibroïne des cassettes dans des tubes coniques de 50 ml et centrifuger deux fois à 9 000 tr/min (~12 700 x g) à 4 °C pendant 20 min. Après chaque étape de centrifugation, versez le surnageant dans un tube frais et jetez la pastille. (40 min)
- Mesurez la concentration de la fibroïne en estimant le poids sec. Versez 1 ml de solution de soie dans une barque de pesée. Faites sécher l’échantillon au four à 60 °C pendant 2 heures. Pesez la fibroïne de soie sèche et calculez la concentration de la solution de fibroïne de soie en multipliant le poids obtenu par 100. La concentration attendue de la solution de soie est de 6 à 9 % (p/v).
- Ajustez la concentration de soie à 6 % (p/v) en la diluant dans de l’eau distillée.
Point d’arrêt : La fibroïne de soie liquide peut être conservée à 4 °C jusqu’à un mois dans un récipient fermé.
- Préparation d’échafaudages poreux à partir d’une solution de soie.
- Tamisez le NaCl granulaire pour séparer les granules de 500 à 600 μm, qui seront utilisés dans les étapes ultérieures. Jeter les granules dont la taille est inférieure à 500 μm et supérieure à 600 μm. (15 min)
- Versez 30 ml de solution de soie à 6 % dans le moule en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (Figure 1). Répartissez délicatement 60 g de NaCl tamisé sur la soie. Tapotez le récipient pour obtenir une couche uniforme de sel. Incuber 48 h à RT pour polymériser la soie.
- Placez le moule en PTFE contenant un échafaudage dans le four à 60 °C pendant 1 heure pour finaliser la polymérisation et évaporer tout liquide restant.
- Placez le contenu du moule en PTFE dans un bécher contenant 2 L d’eau distillée pendant 48 heures pour lessiver le sel. Changez l’eau 2 à 3 fois par jour. Retirez les échafaudages éponges des moules lorsque le sel est complètement lessivé.
Point d’arrêt : Les éponges peuvent être stockées immergées dans l’eau à 4 °C dans un récipient fermé pour éviter la déshydratation des échafaudages.
- Découpez les échafaudages à l’aide d’un poinçon de biopsie de 5 mm de diamètre lorsque vous êtes prêt. Précoupez les échafaudages pour qu’ils atteignent environ 2 mm de hauteur. Perforez le centre de l’échafaudage à l’aide du poinçon de biopsie de 2 mm de diamètre (figure 2A). (1 heure)
- Autoclave les échafaudages immergés dans l’eau pour les stériliser (cycle humide, 121 °C, 20 min).
Point d’arrêt : Les éponges peuvent être stockées immergées dans l’eau à 4 °C dans un récipient fermé pour éviter la déshydratation des échafaudages.
- Avant l’ensemencement cellulaire prévu, immergez les échafaudages dans une solution stérile de poly-D-lysine (PDL) de 0,1 mg/ml. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Lavez les échafaudages 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les PDL non liés. (30 minutes)
2. Isolement des neurones corticaux du rat
- Disséquer les cortex de rats Sprague-Dawley embryonnaires du jour 18 (E18) après l’obtention du protocole animal approuvé. (2 heures)
- Incuber 10 cortex dans 5 ml de trypsine à 0,25 % avec 0,3 % de DNase I (provenant du pancréas bovin) pendant 20 min à 37 °C.
- Inactiver la trypsine en ajoutant 1 mg/ml de protéine de soja.
- Triturez les cortex à l’aide d’une pipette Pasteur de 10 ml en pipetant de haut en bas 20 fois jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit générée. Soyez doux et évitez la formation de bulles d’air. (10 min)
- Centrifuger la suspension cellulaire à 127 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 ml de milieu de culture (milieu neurobasal, 1x supplément de B27, 1x Glutamax, 1 % de pénicilline/streptomycine). Comptez les cellules. La concentration cellulaire attendue est d’environ 2x107/ml (20 min)
3. Construire l’assemblage et la culture
- Ensemencement d’échafaudages avec cellules
- Déplacez les échafaudages stériles et tous les ustensiles nécessaires à l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire. Placez les échafaudages dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits à l’aide d’une pince stérile, en allouant un échafaudage par puits. (10 min)
- Immergez les échafaudages dans le milieu de culture cellulaire pour les équilibrer avant l’ensemencement cellulaire. Incuber pendant 1 h à 37 °C (10 min)
- Aspirez l’excès de fluide des échafaudages.
- Appliquer 100 μl de suspension de cellule/échafaudage. (10 min)
- Incuber les cellules à 37 °C O/N pour permettre la fixation des cellules à l’échafaudage.
- Le lendemain matin, aspirez les cellules non attachées et appliquez 200 μl/puits de milieu de culture frais. (10 min)
- Enrobage d’échafaudage avec matrice de collagène. (2 heures)
- Placez 10 fois plus de PBS, de l’eau, du 1 N NaOH et du collagène I de queue de rat sur de la glace. Préparez une solution de collagène fonctionnelle selon les instructions du fabricant. Maintenir sur la glace jusqu’à ce que les constructions enracinées soient prêtes (jusqu’à 1 heure).
- Retirez les constructions en soie enracinées dans les cellules de l’incubateur et aspirez l’excès de milieu.
- Transférez les échafaudages dans les puits vides sur la plaque du puits à l’aide d’une pince stérile et immergez chaque échafaudage dans 100 μl de solution de collagène à 3 mg/ml. Remettez la plaque de culture tissulaire dans l’incubateur pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation du collagène.
- Appliquez 100 μl de milieu de culture cellulaire préchauffé. Cultivez les constructions pendant une semaine, en changeant le milieu tous les jours en ne remplaçant que la moitié du volume du milieu.
