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1. Période de différenciation avant le replacage
- Différencier les neurones sur des boîtes de 10 cm, à l’aide d’un protocole de choix, jusqu’à ce que les neurones aient formé un réseau épais avec leurs processus et expriment non seulement des marqueurs neuronaux précoces tels que MAP2 ou TuJ1, mais aussi des marqueurs tardifs tels que NeuN.
- Changez la moitié du milieu de votre choix tous les 4 jours pendant le processus de différenciation neuronale.
note: Des changements moyens plus importants ou plus fréquents diluent les facteurs trophiques essentielsaq et pourraient défavoriser la maturation.
- Pour les neurones WT126 dérivés d'iPSC, utiliser les milieux de culture post-différenciation suivants : 5 mL de supplément 100x N2 (neural), 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), 1 μg/mL de laminine, 200 μM d'acide ascorbique, 1 μM de dibutyryl-cAMP et 10 mL de SM1 pour 500 mL de mélange de milieu d'aigle modifié et de nutriments F-12 de Dulbecco (DMEM/F12). Progressivement, en utilisant des changements de demi-média, remplacez-le par un milieu basal neural (tableau des matériaux) et les mêmes suppléments.
- Pour les neurones WT de cellules souches pluripotentes induites ou de CVB WT dérivés d’iPSC, utilisez le milieu de culture post-différenciation suivant : 500 mL de milieu basal neural A (tableau des matériaux) et 500 mL de milieu DMEM/F12 avec 2 μg/mL de laminine, 10 mL de supplément de glutamine (Table des matériaux), 0,75 mg/mL de bicarbonate de sodium, 5 mL de milieu essentiel minimum (MEM) d’acides aminés non essentiels, 0,2 mM d’acide ascorbique, 10 ng/mL de BDNF, 20 mL de 50x B27 et 10 mL de supplément 100x N2.
2. Revêtement des multipuits
- La veille du replacage, enduire de poly-L-ornithine (PLO). Dissoudre le PLO dans de l’eau stérile pour obtenir une solution mère (10 mg/mL). Conservez ce produit à -20 °C. Diluez PLO 1:100 dans l’eau pour obtenir une concentration de 50 μg/mL lors du revêtement du verre et un rapport de 1:1 000 (10 μg/mL) lors du revêtement du plastique.
- Appliquez le revêtement directement sur les plaques cibles. Utiliser le volume de revêtement approprié à la taille de la plaque (c.-à-d. pour une plaque de 24 puits, appliquer 500 μL de solution PLO par puits).
- Laissez les assiettes reposer dans l’obscurité toute la nuit à température ambiante.
- Récupérer les plaques revêtues le jour du replacage et les transférer dans une enceinte de biosécurité stérile.
- Aspirez la solution PLO et rincez deux fois à l’eau stérile.
- Laminine diluée (1,15 mg/mL) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une dilution de 1:400.
note: Décongeler la laminine à 4 °C et l’ajouter rapidement au PBS pour éviter l’agrégation de la laminine et le revêtement inégal.
- Aspirez de l’eau stérile et appliquez 500 μL de revêtement de laminine sur les puits préalablement recouverts de PLO.
- Placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 4 à 6 h. Utilisez des incubations plus longues, jusqu’à 16 h, pour les surfaces en verre. Utilisez des temps d’incubation réguliers.
3. Replacage des neurones différenciés
- Rincez une fois doucement la plaque de neurones différenciés avec du PBS. Dispersez doucement le PBS le long de la paroi de la plaque, et non directement sur les cellules, pour éviter de les perturber.
- Aspirez doucement le PBS en prenant soin d’éviter de toucher directement les cellules mais en aspirant par le bord de la boîte tout en la basculant vers le chercheur.
- Appliquez un minimum de 1 mL de l’enzyme protéolytique (Table des matériaux) par plaque de 10 cm et retournez les cellules dans l’incubateur. Ajoutez des volumes légèrement plus élevés si la salle de culture tissulaire présente un taux d’évaporation élevé en raison d’une faible humidité.
- Incuber des cellules avec l’enzyme protéolytique pendant 40 à 45 minutes afin de les détacher de la plaque et de les détacher des autres neurones du réseau neuronal.
note: Le timing à cette étape est essentiel. Tremper la protéase trop tôt peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire après le replacage. Le fabricant de l’enzyme protéolytique recommande d’utiliser des températures bien inférieures à 37 °C avec des périodes d’incubation plus longues pour les lignées cellulaires de passage (par exemple, toute la nuit à 4 °C). Cependant, il faut éviter de manipuler des neurones à 4 °C, car ils présentent souvent une faible survie après une exposition au froid. Le fabricant affirme également qu’une incubation de 60 minutes avec l’enzyme à 37 °C conduit à son inactivation enzymatique. Cependant, d'après l'expérience des auteurs, une incubation de 40 à 45 minutes de cultures neuronales dérivées de hiPSC à 37 °C est suffisante pour une dissociation efficace et une excellente survie neuronale lors du replacage.
- Vérifiez les neurones sur un microscope à contraste de phase pendant le temps d’incubation et laissez le traitement par protéase se poursuivre jusqu’à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se décomposer en feuilles plus petites en secouant brièvement la plaque sous le microscope.
- Tremper l’activité de la protéase à l’aide de 5 mL de média DMEM frais pour 1 mL de protéase dans la plaque de 10 cm pour arrêter la digestion. Triturez doucement les cellules contre la plaque 5 à 8 fois pour perturber le réseau, à l’aide de pipettes sérologiques. Attention à ne pas appliquer trop de pression lors de la trituration, car les neurones différenciés sont fragiles. N’utilisez pas d’embout P1000, car l’extrémité est trop pointue et trop étroite, et peut donc voiler ou endommager les neurones.
- Appliquer la solution avec les cellules à travers une passoire à cellules avec un maillage de 100 μm de diamètre dans un tube conique frais de 50 mL goutte à goutte.
- Rincez la passoire avec 5 ml supplémentaires de DMEM frais, après que les cellules aient filtré.
- Faites pivoter les cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 1 000 x g pendant 5 min.
- Remettez le tube conique dans l’enceinte de biosécurité et aspirez la majeure partie du milieu, en laissant environ 250 μL pour s’assurer que les cellules retiennent l’humidité.
- Remettez doucement les cellules en suspension dans 2 mL de milieu DMEM frais. Ne pipetez pas la pastille contre le côté du tube. Au lieu de cela, retournez doucement le tube conique 2 à 3 fois et passez les cellules à l’extrémité d’une pipette sérologique de 5 ml pour les déloger.
- Appliquez 10 μL de neurones en suspension sur le bord d’un hémocytomètre.
- Ajoutez 8 à 10 μL de bleu de trypan à la gouttelette des cellules pour évaluer la viabilité cellulaire pendant cette étape de remise en suspension. Appliquez 10 μL de ce mélange sur l’hémocytomètre ou d’autres compteurs automatiques de cellules. Évaluez comme viables les cellules qui sont brillantes en phase brillante et excluez le colorant bleu trypan.
- Déterminez la quantité de cellules viables/ml et préparez-vous à diluer le contenu du tube conique en fonction de la densité cellulaire souhaitée.
- Plaque ~10 000 cellules par puits pour une plaque de 384 puits ; plaque ~150 000-200 000 cellules par puits pour une plaque de 24 puits.
- Ajoutez du DMEM frais dans le tube conique des cellules remises en suspension pour obtenir une dilution appropriée et ajoutez des suppléments appropriés supplémentaires tels que B27 et/ou BDNF, en fonction des exigences de la lignée cellulaire spécifique.
- Inclinez doucement le tube conique pour mélanger 2-3 fois.
- Aspirez le revêtement de laminine de la plaque à 24 puits ou de la plaque à 384 puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux et rincez une fois avec du PBS.
- Aspirez le PBS à l’aide d’un P1000 pour la plaque de 24 puits ou de la pipette à 16 canaux pour les plaques de 384 puits.
- Appliquez la solution cellulaire dans chaque puits en forme de huit pour éviter l’agglutination. L’uniformité du placage peut également être optimisée en utilisant des dispositifs automatisés de manipulation des liquides.
note: L’ajout de laminine au milieu à partir de 2 à 4 jours après le replacage aide également à maintenir une distribution homogène des cellules.
- Répétez les étapes 3.19 et 3.20 pour chaque puits.
- Remettez la plaque dans l’incubateur, réglée à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.
- Après 2 jours, commencer à changer la moitié du milieu tous les 4 jours en utilisant les milieux de culture post-différenciation décrits à la rubrique 1.2.