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1. Fabrication de moules SU-8 par photolithographie
REMARQUE : Cette procédure implique des produits chimiques dangereux. Utilisez une hotte et un EPI partout.
- Nettoyez la plaquette de silicium (4 pouces de diamètre, 1 mm d’épaisseur, polie) avec de l’acétone et soufflez avec de l’azote gazeux. Faites ensuite sécher à 180 °C pendant 3 min.
- Versez 3 ml de SU-8 2100 dans une plaquette nettoyée.
- Enduire uniformément le SU-8 sur la plaquette à l’aide d’une coucheuse de centrifugation à 500 tr/min pendant 10 s, puis essorer séquentiellement à 1500 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 300 tr/min pour obtenir une couche de SU-8.
d’épaisseur de 150 μm
REMARQUE : Assurez-vous que la plaquette de silicium est positionnée au centre de la machine de revêtement de centrifugation et correctement fixée sous vide.
- Faites cuire la gaufrette sur la plaque chauffante à 50 °C pendant 10 min, à 65 °C pendant 7 min et à 95 °C pendant 45 min.
- Réglez le photomasque (Figure 1) sur l’aligneur du masque et exposez-le à la lumière UV (365 nm) pendant 60 s.
REMARQUE : Le temps d’exposition doit être optimisé par une dose appropriée de lumière UV.
- Après l’exposition, cuire la gaufrette à 65 °C pendant 6 min et à 95 °C pendant 13 min sur la plaque chauffante.
- Développer la plaquette pendant 10 à 20 minutes dans un révélateur SU-8 avec agitation à l’aide d’un agitateur orbital, en changeant la solution de développement une fois pendant le processus.
REMARQUE : Prolongez le temps de développement lorsque les débris du SU-8 restent.
- Rincez la plaquette à l’isopropanol et séchez-la doucement avec de l’azote gazeux.
- Mesurez la hauteur du SU-8 déposé à l’aide d’un microscope de mesure et assurez-vous qu’il a une épaisseur d’environ 150 m. Il peut être conservé indéfiniment à température ambiante.
2. Fabrication de puces de culture tissulaire à base microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS)
- Fixez la plaquette déposée SU-8 à un récipient (par exemple, une boîte de Pétri en plastique de 15 cm) à l’aide de ruban adhésif double face.
- Soufflez la poussière de la plaquette à l’aide d’azote gazeux.
- Pour silaniser, placez la plaquette déposée dans le SU-8 dans une chambre à vide avec un petit récipient (par exemple, une boîte de 35 mm). Déposer 10 μL de (tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl)-1-trichlorosilane dans le petit contenant. N’appliquez pas directement le (tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl)-1-trichlorosilane sur la plaquette SU-8.
- Fermez hermétiquement la chambre à vide et allumez une pompe à vide pendant au moins 2 h.
- Prenez un gobelet en plastique et versez l’élastomère de silicone (par exemple, Silpot 184 ou équivalent, Sylgard 184) et l’agent de durcissement à un rapport de poids de 10:1. Ensuite, mélangez bien à l’aide d’une spatule et dégazez dans la chambre à vide jusqu’à ce que les bulles soient entièrement éliminées.
- Versez le mélange PDMS dans le récipient avec la plaquette SU-8 à l’épaisseur souhaitée (3-4 mm) et dégazez à nouveau pour éliminer les bulles.
- Faites cuire le PDMS dans un four à 60 °C pendant au moins 3 heures pour durcir complètement le PDMS.
- Après refroidissement, coupez le PDMS durci de la plaquette à l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir.
- Pour créer les deux chambres de la puce de culture tissulaire, percez deux trous à l’endroit où se trouvent les deux compartiments à l’aide d’un poinçon de biopsie de 1,5 mm de diamètre.
- Pour créer un réservoir moyen, préparez un autre mélange PDMS (élastomère de silicone et agent de durcissement à un rapport de poids de 10:1) et versez-le dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm. Ajustez le volume de coulée à 5 mm d’épaisseur de PDMS.
- Faites cuire le PDMS dans un four à 60 °C pendant au moins 3 heures pour durcir complètement le PDMS.
- Après avoir refroidi le PDMS, coupez le PDMS durci avec un scalpel pour obtenir un anneau rectangulaire.
- Collez la couche inférieure avec le réservoir moyen en appliquant du PDMS non durci entre elles et en cuisant les couches PDMS assemblées. Cette structure collée permet d’obtenir la puce de culture tissulaire PDMS.
- Nettoyez la puce de culture tissulaire PDMS à l’aide d’un scotch tape pour enlever la poussière et les petites particules de la surface. Les puces de culture tissulaire PDMS peuvent être stockées à température ambiante si elles sont protégées de la poussière et des UV.
3. Préparation de la culture
- Milieu de culture
note: Tous les milieux énumérés ci-dessous doivent être filtrés pour la stérilisation, sauf indication contraire. Les milieux préparés peuvent être conservés à 4 °C et utilisés dans un délai d’un mois.
- Pour préparer le milieu mTeSR Plus : combinez une bouteille de 100 ml de supplément mTeSR Plus 5x avec une bouteille de 400 ml de milieu basal mTeSR Plus.
- Pour préparer 100 mL de milieu KSR : Dans 85 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco ou de DMEM/F12, ajoutez 15 mL de sérum de remplacement Knockout (KSR, 15 %), 1 mL de supplément commercial de glutamine (1 %) et 1 mL d'acide aminé non essentiel (NEAA, 1 %).
- Pour préparer 100 ml de milieu N2 : Dans 100 ml de milieu neurobasal, ajoutez 1 ml de N2 (100x), 1 ml de supplément commercial de glutamine et 1 ml de NEAA.
- Pour préparer 250 mL de milieu de maturation : Dans 250 mL de milieu neurobasal, ajoutez 5 mL de B27 (2 %), 2,5 mL de supplément commercial de glutamine (1 %) et 2,5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %).
- Remettre en suspension les composés (acide rétinoïque (AR), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) dans du DMSO de qualité culture cellulaire à la concentration souhaitée. Préparez des aliquotes et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois. Les solutions mères suivantes sont utilisées : 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Revêtement
note: Pour éviter la polymérisation de la matrice de la membrane basale par la chaleur, évitez les cycles répétitifs de gel-dégel. Gérez toutes les procédures de revêtement avec des pointes de pipette et des tubes pré-refroidis si possible. La matrice de la membrane basale doit être décongelée pendant la nuit à 4 °C et aliquote à l’aide d’embouts de pipette et de tubes pré-refroidis. Les aliquotes peuvent être congelées à -20 °C ou -80 °C.
- Décongeler l’aliquote congelée à 4 °C sur de la glace. L’aliquote doit être conservée au froid pendant la procédure de revêtement. À l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie, diluez la matrice de la membrane basale avec du DMEM/F12 glacé dans un rapport de 1:40. La matrice de membrane basale diluée non utilisée peut être stockée à 4 °C pendant 2 à 3 jours, à condition qu’il n’y ait pas eu de polymérisation.
- Ajouter 1 mL de la solution de matrice de membrane basale/DMEM-F12 pour enrober un puits de la plaque à 6 puits.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant au moins une heure, ou 4 °C pendant la nuit. Les plaques revêtues peuvent être stockées à 4 °C pendant une semaine au maximum.
4. Maintenance des cellules iPS
- Préparez des plats recouverts d’une matrice de membrane basale comme mentionné précédemment à l’étape 3.2.
- Aspirez complètement le fluide mTeSR Plus. Lavez le puits une fois avec du PBS et ajoutez 0,5 mL de réactif de passage (voir le tableau des matériaux). Attendez quelques secondes et aspirez la solution.
- Incuber la plaque à 37 °C dans l’incubateur pendant 5 min ou jusqu’à ce que les cellules deviennent rondes.
note: Le temps d’incubation peut varier entre les différentes lignées cellulaires iPS et la confluence. Veuillez vérifier périodiquement au microscope pour déterminer le temps de dissociation pendant l’incubation.
- Ajouter 1 mL de milieu mTeSR Plus et tapoter la plaque pendant 30 à 60 s pour détacher les colonies.
- Mélangez délicatement 1 mL de la solution de suspension cellulaire avec 7 mL de milieu mTeSR plus frais. Ne pipetez pas plus de 5 fois.
- Plaque dans un rapport de 1:8. Ajouter généralement 1 mL de la suspension à partir de l’étape 5.5 et ajouter 1 mL de mTeSR plus un milieu complété par 5-10 μM de Y-27632 (inhibiteur de ROCK). Le taux de dilution de passage dépend de la ligne iPSC.
- Placez la cellule dans un incubateur à 5 % de CO2/37 °C. Le lendemain, retirez Y-27632 en ajoutant du milieu mTeSR Plus frais. Par la suite, changez de milieu tous les deux jours au début, puis tous les jours à mesure que la cellule atteint une confluence plus élevée.
5. Différenciation des cellules iPS en motoneurones
- Passage de l’iPSC pour la différenciation des motoneurones
note: La différenciation peut être effectuée avec succès dans le protocole 3D (5.2).
- Laisser les cellules iPS indifférenciées se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 80 % dans le milieu mTeSR Plus dans une plaque à 6 puits.
- Aspirez complètement le support. Lavez immédiatement le puits une fois avec du PBS stérile et ajoutez 0,5 ml de solution de dissociation cellulaire aux cellules.
- Incuber la plaque à 37 °C dans l’incubateur pendant environ 2 à 3 minutes, ou jusqu’à ce que les cellules se séparent et s’arrondissent, mais restent attachées au puits.
- Ajouter 1 ml de milieu et pipeter doucement de haut en bas à quelques reprises à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL composé de 4 mL du fluide.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
- Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant la pastille intacte, et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complété par 10 μM de Y-27632.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et passez à 5.2 (différenciation 3D).
- Formation de sphéroïde du motoneurone (MNS) dans la différenciation 3D (« protocole 3D »)
note: Un changement complet de milieu est effectué quotidiennement entre les jours 0 et 12 de différenciation (Figure 2).
- Ensemencer les cellules iPS de l’étape 5.1.7 vers une plaque inférieure U de 96 puits à 40 000 cellules/puits dans 100 μL de mTeSR Plus complété par 10 μM de Y-27632.
- Le lendemain, remplacez chaque puits par 100 μL de milieu frais.
- Les jours 0 et 1 : Aspirer le milieu de culture et le remplacer par 100 μL de milieu KSR (3.1.2) complété par 10 μM SB431542 et 100 nM de LDN-193189.
- Les jours 2 et 3 : Aspirer le milieu de culture et le remplacer par 100 μL de milieu KSR complété par 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA et 1 μM SAG.
- Les jours 4 et 5 : Préparez un milieu mixte composé de 75 % de milieu KSR et de 25 % de milieu N2 (3.1.3). Ensuite, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par 100 μL de milieu mixte complété par 10 μM SB431542, 100 μM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA et 1 μM SAG.
- Les jours 6 et 7 : Préparez un milieu mixte composé de 50 % de milieu KSR et de 50 % de milieu N2. Ensuite, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par 100 μL de milieu mixte complété par 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM d’acide rétinoïque et 1 μM SAG.
- Les jours 8 et 9 : Préparez un milieu mixte composé de 25 % de milieu KSR et de 75 % de milieu N2. Ensuite, aspirer le milieu de culture et le remplacer par 100 μL de milieu mixte complété par 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA et 1 μM SAG.
- Les jours 10 et 11 : Remplacer le milieu par 100 μl de milieu N2 complété par 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA et 1 μM SAG.
- Le jour 12 : Procéder au transfert des MN dans la puce de culture tissulaire (étape 6) ou remplacer le milieu par 100 μL du milieu de maturation (3.1.4) complété par 20 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF).
note: Le MNS peut être transféré sur la puce de culture tissulaire à partir du 12e au 19e jour. Les sphéroïdes qui ne sont pas transférés doivent être conservés cultivés dans des plaques inférieures à 96 puits en U dans un milieu de maturation complété par 20 ng/mL de BDNF jusqu’au transfert.
6. Préparation de la puce de culture tissulaire pour la formation d’organoïdes nerveux moteurs (MNO)
- Stérilisez le PDMS préparé (à partir de l’étape 2.13) en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % dans la boîte de Pétri pendant au moins 1 h.
note: Toutes les étapes suivantes doivent être manipulées dans une enceinte de biosécurité.
- Stérilisez le verre du microscope (76 x 52 mm) en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % dans la boîte de Pétri.
- Pendant le processus de séchage du verre du microscope, placez l’appareil PDMS sur le verre du microscope à moitié humide et laissez-le sécher complètement en attendant toute la nuit. Une fois complètement sec, le dispositif PDMS doit adhérer au verre.
note: Cette liaison n’est pas permanente pour permettre le détachement des dispositifs PDMS de la vitre du microscope après la culture pour le prélèvement de tissus. La liaison permanente par plasma d’oxygène peut être utilisée pour maximiser l’adhérence entre le PDMS et le verre, mais elle interdirait le démontage des puces et la collecte de tissus.
- Enduire la surface du microcanal dans le dispositif PDMS et le verre du microscope avec 30 μL de matrice de membrane basale diluée dans DMEM/F12 (1:40) en faisant une gouttelette d’un côté de l’entrée du canal, puis aspirer la solution de l’autre côté de l’entrée avec une pipette ou une pompe d’aspiration (Figure 3A). N’aspirez pas trop de volume de solution pour éviter la contamination par des bulles.
- Ensuite, incubez le dispositif PDMS pendant 1 heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C dans un récipient secondaire (par exemple, une boîte de Pétri).
7. Formation des organoïdes nerveux moteurs (MNO)
- Remplacer la solution d’enrobage par 150 μL de milieu de maturation préchauffé complété par 20 ng/mL de BDNF juste avant l’utilisation.
- Ensuite, placez le MNS de l’étape 5.2.9 dans l’entrée du microcanal à l’aide d’une micropipette avec une pointe à large diamètre. Les MNS peuvent se déposer spontanément au fond de l’appareil par gravité. N’appliquez pas trop de pression lors de l’injection du MNS (Figure 3B).
note: Si le MNS est coincé sur la paroi latérale d’un trou dans une puce de culture tissulaire, aspirez doucement la solution d’un autre côté de l’entrée.
- Remplissez un petit réservoir (p. ex. un bouchon de tube de 15 ml) d’eau stérile et placez-le à proximité de la puce de culture tissulaire dans le récipient secondaire pour éviter l’évaporation du milieu. Ensuite, placez-le dans un incubateur à 5 % de CO2/37 °C.
- Pour un changement de milieu, aspirer le milieu de culture épuisé à partir du centre du réservoir de milieu (figure 3C). N’aspirez pas tout le milieu et les tissus.
- Ajouter délicatement du milieu de maturation frais (avec du BDNF). Le support doit être changé tous les 2-3 jours. Ne séchez pas le milieu de culture à aucun moment pendant la culture. Les axones se développent à partir d’un MNS dans le canal et s’assemblent spontanément en un seul faisceau en 2 à 3 semaines, ce qui entraîne la formation d’un MNO. MNO peut être cultivé pendant plus de 1 mois supplémentaire dans l’appareil.
