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1. Cultures cellulaires et prédifférenciation
- Culture et prédifférenciation de cellules souches neurales
- Préparez des lamelles enrobées de poly-D-lysine. Insérez une lamelle stérile (20 mm de diamètre) dans une plaque à 12 puits. Enduire le verre de protection de poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans de l’eau pour une meilleure adhérence cellulaire sur les lamelles en suivant les étapes suivantes.
REMARQUE : Les conditions optimales doivent être déterminées pour chaque lignée cellulaire et chaque application.
- Enduire aseptiquement la surface de la lamelle de poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans de l’eau. Basculez doucement pour assurer un revêtement uniforme de la surface de la lamelle.
- Après la culture pendant une nuit (~12 h) à 37 °C, retirer la solution de poly-D-lysine et rincer la surface 3 fois avec 1 mL d’eau stérile.
- Séchez les cellules au moins 30 min avant de les semer.
- Culture et prédifférenciation de cellules souches neurales murines en C17.2 (C17.2-NSC)
- Incuber les CSN-C17.2 dans une fiole de25 cm dans un milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 5 % de sérum de cheval (HS) et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C et 5 % de CO2 pendant ~2 à 3d.
- Lorsque les cellules atteignent 85 % de confluence, retirez le milieu, lavez-les avec 1 mL de PBS et ajoutez 1 mL de trypsine fraîche (0,25 %) dans le flacon. Laisser reposer 1 min ; ensuite, ajouter 1 mL de milieu de culture dans la fiole et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Comptez la densité des cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume requis de suspension cellulaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 2 x 104 cellules/mL.
- Ensemencez les CSN-C17.2 sur les lamelles enrobées de la plaque de 12 puits d’une densité de ~2 x 104 cellules par puits. Vérifier la densité cellulaire au microscope.
REMARQUE : Pour un meilleur résultat, la densité cellulaire optimale doit être déterminée avant l’expérience d’immunofluorescence.
- Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur cellulaire pendant 12 h pour permettre la fixation.
- Après la fixation, laver les cellules 2 fois avec 1 mL de PBS et cultiver les cellules avec un milieu de différenciation composé de DMEM/F12 avec un supplément de 1 % de N2 pendant 48 h avant le traitement au plasma.
- Culture et prédifférenciation de cellules souches neurales primaires de rat
- Cultiver la suspension primaire de cellules souches neurales (NSC) de rat dans un milieu de croissance de NSC de rat dans des flacons T25 non enrobés à une densité de 5 x 105 cellules.
- Vérifiez la formation des neurosphères au microscope inversé. Assurez-vous que la morphologie des neurosphères présente des complexes multicellulaires sphériques et transparents.
- Lorsque les neurosphères atteignent un diamètre de 3 mm ou plus, transférez la suspension de la neurosphère dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et laissez les neurosphères se déposer par gravité.
- Retirez le surnageant avec précaution pour laisser les neurosphères dans un volume minimal de milieu.
- Rincez les neurosphères 1x avec 5 mL de PBS et laissez les neurosphères se déposer par gravité. Retirer le surnageant pour laisser un volume minimal de PBS.
- Ajoutez un volume approprié de milieu de différenciation pour ajuster la densité cellulaire à ~12 - 15 neurosphères par millilitre. Le milieu de différenciation des CSN primaires de rat se compose de DMEM/F12, de 2 % de B27 et de 1 % de FBS.
- Semez 1 mL de suspension de neurosphère sur chaque lamelle enrobée de la plaque à 12 puits.
REMARQUE : Secouez doucement la plaque pour vous assurer que les neurosphères sont uniformément réparties. Cette étape est essentielle pour un meilleur résultat d’immunofluorescence.
- Placez la plaque dans l’incubateur et laissez-la se prédifférencier pendant 24 h avant le traitement au plasma.
2. Préparation des jets de plasma
- Choisissez un tube en quartz semi-ouvert d’un diamètre intérieur de 2 mm et d’un diamètre extérieur de 4 mm. Insérez un fil haute tension d’un diamètre de 2 mm dans le tube.
- Insérez le tube de quartz avec le fil haute tension dans une seringue de 5 ml et utilisez un support pour le monter à l’intérieur du centre de la seringue. Réglez la distance entre l’extrémité scellée du tube en quartz et l’embout de la seringue à 1 cm.
- Connectez un tuyau en caoutchouc de silicone de 1 m (d’un diamètre intérieur de 12 mm) à l’extrémité ouverte de la seringue, puis connectez-le au débitmètre et à la vanne de gaz en séquence.
3. Acquisition des Jets
- Connectez le circuit comme illustré à la Figure 1. Connectez le fil de sortie de l’alimentation à l’appareil à jet de plasma, puis connectez l’extrémité de la sonde haute tension avec le fil de sortie pour détecter la tension. Connectez l’autre extrémité de la sonde haute tension à l’oscilloscope pour enregistrer les informations de la tension de sortie. Vérifiez l’ensemble du circuit et assurez-vous que l’alimentation, l’oscilloscope et la sonde haute tension sont tous mis à la terre.
- Vérifiez la conduite de gaz. Assurez-vous que le tube de gaz a été connecté à l’appareil à jet de plasma ; Ensuite, ouvrez la vanne de gaz de l’hélium (fraction volumique, 99,999 %) et de l’oxygène (fraction volumique, 99,999 %) et réglez le débit de gaz à 1 L : 0,01 L/min (He :O2).
REMARQUE : Laissez le gaz couler pendant plusieurs minutes avant d’allumer l’alimentation électrique pour la première fois.
- Définissez l’amplitude, la fréquence et la largeur d’impulsion sur 8 kV, 8 kHz et 1600 ns, respectivement. Vérifiez à nouveau le circuit, puis allumez le bouton de sortie pour créer un jet de plasma.
ATTENTION : Ne touchez à aucun moment le fil haute tension.
4. Traitement plasmatique des cellules souches neurales
- Réglez la distance entre la buse de la seringue et le trou du puits de la cellule à 15 mm.
REMARQUE : La distance est mesurée à partir du bas de la plate-forme où la plaque à 12 puits est placée.
- Sortez la plaque à 12 puits de l’incubateur et changez le milieu des cellules prédifférenciées en 800 μL de milieu de différenciation frais.
- Divisez les cellules en trois groupes : un groupe témoin non traité, un groupe de traitement à flux gazeux 60 s He-and-O2 (1 %) et un groupe de traitement plasma 60 s.
REMARQUE : Il n’y a pas de perte de liquide évidente dans les conditions de traitement.
- Placez la plaque à 12 puits sous les jets de plasma, assurez-vous que la buse de la seringue est fixée au centre de chaque trou, et administrez le traitement approprié aux différents groupes mentionnés à l’étape 4.3.
REMARQUE : Les témoins non traités ont été conservés dans un milieu de différenciation à température ambiante pendant la procédure expérimentale afin d’assurer des conditions de traitement uniformes. Le groupe de traitement à flux gazeux He-and-O2 (1 %) a été traité avec seulement un flux gazeux He et O2 (1 %), sans génération de plasma. Tous les traitements doivent être effectués en trois exemplaires.
5. Différenciation des cellules souches neurales
- Après le traitement, retirer la culture d’origine et ajouter 1 mL de nouveau milieu de différenciation dans chaque puits.
- Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 jours. Changez de milieu tous les deux jours.
- Vérifiez quotidiennement l’état de différenciation des différents groupes à l’aide d’un microscope optique à contraste de phase inversé Figure 2. Sélectionnez au hasard au moins 12 champs et prenez des photos pour enregistrer les changements morphologiques.
