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1. Préparation des milieux
REMARQUE : Réchauffer tous les supports à 37 ° ; C avant l’utilisation en culture cellulaire.
- Milieu de fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) (pour la préparation de 500 ml)
- Ajouter 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) à 449 ml de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco et filtrer à travers une unité de filtre à pores de 0,22 μm de 500 ml.
- Ajouter 1 mL d’agent antimicrobien (50 mg/mL) après la filtration. Stockez le support à 4 °C jusqu’à 1 mois ou aliquote et stockez-le à ≤ -20 °C.
- Milieu N2 (pour la préparation de 500 ml)
- Ajouter 5 mL de L-alanine-L-glutamine (100x) et 500 μL de 2-Mercaptoéthanol (55 mM) à 489,5 mL de DMEM : Mélange d’éléments nutritifs F-12 (DMEM/F-12), et filtrer à travers une unité de filtre à pores de 500 mL de 0,22 μm.
- Ajouter 1 mL d’agent antimicrobien (50 mg/mL) et 5 mL de supplément N2-B après filtration. Stockez le support à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 mois.
- Milieu de culture sans sérum (KSR) (pour la préparation 500 mL)
- Ajoutez 75 ml de supplément de milieu sans sérum, 5 ml de L-glutamine (100x), 5 mL d’acides aminés non essentiels MEM (MEM-NEAA) (100x) et 500 μL de 2-Mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL de DMEM non contenant de la glutamine, et filtrez à travers une unité de filtre à pores de 500 mL 0,22 μm.
- Ajouter 1 mL d’agent antimicrobien (50 mg/mL) après la filtration. Conservez le support à 4 °C pendant 1 mois maximum.
- Milieu de cellules souches embryonnaires de souris (pour la préparation de 500 ml)
- Ajouter 75 mL de FBS de qualité cellules souches, 5 mL DE MEM-NEAA (100x), 5 mL de L-glutamine (100x) et 500 μL de 2-Mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL de DMEM non contenant de la glutamine, et filtrer à travers une unité de filtre à pores de 0,22 μm de 500 mL.
- Ajouter 1 mL d’agent antimicrobien (50 mg/mL) après la filtration. Stockez le support à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 mois ou aliquote et stockez-le à ≤ -20 °C.
2. Culture des mESC
- Déposer des cellules nourricières de MEF inactives mitotiquement dans un milieu MEF sur des plaques traitées pour culture tissulaire à 3-4 x 104 cellules/cm2. Attendez au moins 12 heures pour qu’ils s’installent dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative et 5 % de CO2 avant de plaquer les CSEm. S’il n’est pas utilisé immédiatement, remplacez le support MEF tous les 3 jours. Jetez les MEF s’ils ne sont pas utilisés dans les 7 jours suivant le placage.
- Ajouter des CSEm (plage de densité de 1 à 4 x 10,4 cellules/cm2) à des plaques MEF dans des milieux CSEm contenant du facteur inhibiteur de la leucémie de souris (mLIF) (1 000 U/mL). Incuber les cellules à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative et 5 % de CO2.
- Passage des CSEm à l’aide de trypsine-EDTA (0,05 % de trypsine) (1:5-1:10) une fois que la boîte devient ~ 70-80 % confluente ou si les colonies commencent à se toucher. Cela se produit généralement tous les 2 jours, mais peut prendre jusqu’à 4 ou 5 jours, selon la densité initiale du placage.
- Maintenez les mESC sur une couche d’alimentation MEF dans un milieu mESC pour conserver la pluripotence.
- Avant de commencer la différenciation, passez les cellules au moins une fois sur des plaques recouvertes de gélatine sans MEF pour diluer les MEF.
- Préparez des plaques recouvertes de gélatine en ajoutant 0,1 % de gélatine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2+/Mg2+ dans une boîte traitée par culture tissulaire et en laissant à 37 °C pendant au moins 1 h. Plaque 1,5-2 x 10 6 cellules/10 cm (2,7-3,6 x 104 cellules/cm2) et laissez les cellules se développer pendant 2 jours avant de commencer la différenciation.
3. Différenciation des CSEm vers des progéniteurs télencéphaliques de type MGE
- Jour de différenciation (JJ) 0 = « cellules flottantes »
- Une fois que les CSEm se sont développées sur des plaques recouvertes de gélatine pendant 2 jours, aspirez le milieu et lavez une fois les cellules avec du PBS sans Ca2+/Mg2+. Ajoutez suffisamment de trypsine-EDTA (0,05 % de trypsine) pour couvrir la surface de la plaque (généralement 4 mL de trypsine-EDTA pour une boîte de culture tissulaire de 10 cm) et remettez les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec ≥95 % d’humidité relative et 5 % de CO2 pendant 4 min.
- Après 4 min, tremper la trypsine-EDTA en utilisant 2 fois le volume avec un milieu mESC. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée et centrifugez-les à 200 x g pendant 5 min. Au bout de 5 min, retirez le tube et aspirez le média sans déranger la pastille. Remettre la pastille en suspension dans un milieu KSR :N2 de 1 mL (1:1) contenant l’inhibiteur de BMP LDN-193189 (250 nM) et l’inhibiteur de Wnt XAV-939 (10 μM).
- Mesurez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Commencez à cultiver des cellules sous forme de corps embryoïdes (EB) en ajoutant 75 000 cellules/ml dans un milieu KSR :N2 (1:1) contenant LDN-193189 (250 nM) et XAV-939 (10 μM) dans des boîtes de culture tissulaire non adhérentes. Incuber les cellules à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative et 5 % de CO2.
- À JD1, préparer l’atterrissage cellulaire en enrobant des boîtes traitées pour culture tissulaire de poly-L-lysine (10 μg/mL dans du PBS avec Ca2+/Mg2+) pendant une nuit (O/N) à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative ou pendant au moins 1 h.
- Sur DD2, aspirer la poly-L-lysine et enduire les plaques de laminine (10 μg/mL dans le PBS avec Ca2+/Mg2+) O/N à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative.
note: Bien que l’O/N soit optimal, aussi peu que 2 h peuvent suffire. Si les plaques ne sont pas utilisées le lendemain, aspirez la laminine, remplacez-la par du PBS sans Ca2+/Mg2+ et conservez-la à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- DD3 (« cellules terrestres »)
- Avant de commencer la dissociation de l’EB, aspirez la laminine et laissez les plaques sécher complètement dans une hotte de culture tissulaire. N’utilisez pas de plaques qui semblent brillantes ou visiblement mouillées. Transvasez les EB avec le milieu dans un tube de 15 mL et centrifugez-les pendant 3 à 4 min à 15 x g ou jusqu’à ce que les EB aient granulé.
- Aspirez le milieu et ajoutez 3 mL de solution de détachement cellulaire contenant de la DNase (2 U/mL) et incubez à 37 °C avec ≥ 95 % d’humidité relative et 5 % de CO2 pendant 15 min. Agitez doucement le tube toutes les 3 min pour faciliter la dissociation de l’EB.
- Une fois que les EB ne sont plus visibles ou que 15 minutes se sont écoulées, ajouter 6 mL de KSR :N2 (1:1) contenant de la DNase (1 U/mL) et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.
- Plaquez les cellules dans KSR :N2 (1:1) contenant LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) et l’inhibiteur de ROCK Y-27632 (10 μM) à 4,5-5 x 104 cellules/cm2.