Génération de progéniteurs neuraux à partir de cellules souches embryonnaires de souris par la méthode de la goutte suspendue

Résumé

Source : Hanafiah, A., et al. Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuraux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en corps embryoïdes (EB) par la méthode de la goutte suspendue. Lors de la suspension des CSEm dans des gouttes suspendues et de l’incubation, les cellules s’agrègent pour former des EB, qui sont ensuite différenciées en cellules progénitrices neuronales (NPC) à l’aide d’un milieu de différenciation complété par de l’acide rétinoïque (AR).

Protocole

1. Culture de mESC

1. Enduire une plaque de 10 cm de gélatine à 0,1 % et laisser la gélatine prendre pendant au moins 15 à 30 minutes avant de l’aspirer.
2. Sem γ ez des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) irradiés un jour avant de cultiver les mESC dans le milieu mESC préchauffé (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 15 % de sérum de bovin fœtal (FBS), des acides aminés non essentiels, du β-mercaptoéthanol, de la L-glutamine, de la pénicilline/streptomycine, du pyruvate de sodium, du facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), du PD0325901 () et du CHIR99021 (CH)).
3. Laissez les MEF irradiés par γ se déposer et se fixer à la surface de la plaque avant de cultiver les cellules E14.
4. Décongelez les ESC E14 dans un bain-marie à 37 °C et transférez rapidement les cellules dans un tube conique de 15 cm avec un milieu mESC chaud. Granulez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
5. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu mESC et déposer les cellules sur la plaque de culture contenant les MEF irradiés par γ ensemencés précédemment. Incuber la culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C sous 5 % de CO₂.
6. Pour le passage de la culture, aspirez le milieu et lavez la plaque avec une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter suffisamment de trypsine à 0,05 % pour couvrir la surface de la plaque et incuber à 37 °C pendant 3 min.
7. Neutralisez la trypsine avec un milieu mESC et une pipette pour générer une suspension unicellulaire. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules et ensemencez environ 5,0 x 10⁵ cellules dans une plaque de culture de 10 cm.
9. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu mESC, placer les cellules sur la plaque de culture tissulaire enrobée de gélatine et incuber les cultures comme décrit précédemment.
   note: Il est recommandé de faire passer les CSEm tous les 2 jours pour éviter que les cellules ne se différencient dans leurs colonies. Le rouge de phénol dans le milieu fonctionne uniquement comme un indicateur de pH et, en fonction de la densité cellulaire, il peut devenir jaunâtre (plus acide), en moins de 2 jours. Par conséquent, il peut être nécessaire de changer de support tous les jours. Les MEF irradiés par γ finiront par mourir après quelques passages.

2. EB, NPC et différenciation des neurones

1. Effectuer le protocole de passage de culture et compter les cellules.
2. Méthode de la chute suspendue (jour 0)
   1. Pour une plaque de culture cellulaire de 10 cm, comptez environ 2,5 x 10⁴ cellules où 5,0 x 10² cellules seront en suspension dans un milieu de différenciation de 20 μL (DMEM avec 15 % de FBS, acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et pyruvate de sodium). Une cinquantaine de gouttelettes de 20 μL contenant les cellules peuvent être plaquées sur une plaque de 10 cm.
   2. Aliquote le nombre approprié de cellules, puis centrifuge les cellules à 200 x g pendant 3 min et retire le surnageant.
   3. Remettre les cellules en suspension dans le volume approprié de milieu de différenciation pour une densité cellulaire de 5,0 x 10² cellules par 20 μL (p. ex. 2,5 x 10⁴ cellules dans 1 mL de milieu de différenciation).
   4. À l’aide d’une micropipette ou d’une pipette à répéteur, déposer des gouttelettes de 20 μL de suspension cellulaire sur le couvercle de la plaque de culture tissulaire. Assurez-vous que les gouttelettes ne sont pas trop proches les unes des autres pour éviter qu’elles ne fusionnent.
      note: Les gouttelettes peuvent être plaquées sur une plaque de fixation traitée par culture tissulaire ou sur une plaque de suspension, car elles seront placées sur le couvercle et non sur la plaque elle-même. Pour une approche plus réalisable et stérile, placez les gouttelettes sur une plaque de culture tissulaire de fixation et transférez-les sur une plaque de suspension comme décrit ci-dessous.
   5. Remplissez l’assiette avec 5 à 10 ml de 1x PBS et remettez soigneusement le couvercle sur l’assiette. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C.
      note: Le PBS est ajouté à la plaque de culture pour éviter que les gouttelettes ne se dessèchent.
3. Le jour 2, à l’aide d’une micropipette, recueillir les gouttelettes du couvercle et les placer dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 cm remplie de 10 ml de milieu de différenciation. Incuber la culture sur un agitateur orbital en secouant à basse vitesse dans l’incubateur.
4. Le jour 4, pour récolter les EB, récupérez les cellules, centrifugez à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
   note: Les EB peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les exigences des expériences ultérieures.
5. Pour poursuivre la procédure et induire la différenciation EB en cellules progénitrices neurales (NPC), préparez le milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque (AR) 5 μM.
6. Retirez l’ancien milieu en granulant les EB à 100 x g pendant 3 min ou laissez les EB se décanter avant d’aspirer l’ancien milieu. Ajouter 10 mL du milieu de différenciation contenant 5 μM d’AR dans la plaque de culture.
7. Le jour 6, remplacez au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant 5 μM d’AR en inclinant la plaque et en pipetant le milieu comme décrit ci-dessus.
   note: Il est recommandé de remplacer au moins la moitié du milieu par du milieu frais contenant de l’AR les jours 5 et 7. Prenez note de l’indicateur rouge de phénol ; S’il devient jaunâtre, il est préférable de remplacer tout le milieu.
8. Le jour 8, récoltez les PNJ en collectant les cellules, en centrifugeant à 200 x g pendant 3 min, et en retirant le surnageant.
   note: Les NPC peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les besoins des expériences ultérieures. Si nécessaire, les PNJ peuvent être congelés et décongelés à nouveau pour une culture et une analyse ultérieures. Si les NPC doivent être cultivés, l’accutase peut également être utilisée comme alternative à la trypsine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % de trypsine + 0,53 mM d’EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0,1 % de gélatine	sigma	G1890-100G	Préparé dans de l’eau désionisée
CHIR99021	Produits chimiques des îles Caïmans	Référence 13122
DMEM	Corning	Référence 10-017-CM
DMEM/F12 moyen	Thermo Fisher Scientific	11320033
Tampon EB	Qiagen	19086
éthanol	111000200	Pharmco	Dilué dans de l’eau désionisée
Sérum fœtal bovin	Produits biologiques d’Atlanta	Réf. S10250
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Frv	n/a	n/a	Prélevé sur le surnageant MEF
MEM Acides aminés non essentiels	Corning	Référence 25-025-CL
PD0325901	Produits chimiques des îles Caïmans	Référence 13034
Pénicilline/streptomycine	Corning	30-002-CL
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	n/a	n/a	Préparé dans de l’eau désionisée
chlorure de potassium	P217-500G	VWR
Phosphate de potassium monobasique anhydre	Référence 0781-500G	VWR
chlorure de sodium	BP358-10	Bioréactifs Fisher
Phosphate de sodium, dibasique, heptahydraté	Référence : SX0715-1	Le milipore
Acide rétinoïque	sigma	R2625	Préparé en DMSO
Pyruvate de sodium	Corning	25-000-CL
β-mercaptoéthanol	Bioréactifs Fisher	BP176-100