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1. Induction des cellules souches neurales
REMARQUE : Selon les conditions cellulaires, environ 5 ou 7 jours après la transfection, les cellules adhérentes monocouches atteindront une confluence de 30 à 50 % (Figure 1C).
- Retirez les surnageants contenant des cellules et des sphères flottantes, puis ajoutez 1 ml de milieu progéniteur neural (milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange nutritif F-12 (DMEM/F12), contenant 1 supplément de N2, 0,1 % (p/v) d'albumine sérique bovine (BSA), 1 % (v/v) d'antibiotiques, 20 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) et 20 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF)) dans les cellules adhérentes.
- Si vous le souhaitez, dissociez les sphères cellulaires en pipetant doucement et en centrifugant les cellules à 170 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 ml de milieu progéniteur neural dans une nouvelle plaque à 24 puits recouverte de matrigel selon les instructions en guise de sauvegarde.
- Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 60 à 80 % de confluence, généralement après 1 semaine.
- Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de cellules souches neurales (milieu sans sérum, NSC SFM). Dissocier les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire, suivi d’un pipetage très doux.
- Retirez les cellules et épépinez-les toutes dans un puits d’une plaque à 6 puits. Ajoutez encore 1 ml de milieu de cellules souches neurales pour faire 2 ml de milieu pour chaque puits. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
- Changez de support tous les deux jours.
- Lorsque les cellules atteignent 60 % de confluence, dissociez-les et replaquez-les selon un rapport de 1:3 en suivant les étapes des sections 1.4 et 1.6.
