Silençage génique médié par siRNA dans des cellules souches neurales

Résumé

Source : Nguyen, B. H., et al. Culture et manipulation des cellules de la crête neurale O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Cette vidéo montre l’utilisation de petits ARN interférents (siRNA) pour réduire au silence des gènes d’intérêt spécifiques dans les cellules souches neurales et les différencier en types de cellules souhaités en utilisant un milieu de différenciation approprié. Cette procédure permet d’étudier le rôle critique de gènes spécifiques dans le processus de différenciation des cellules souches neurales.

Protocole

1. Manipulation des cellules O9-1

1. Réalisation de l’inactivation de siRNA dans les cellules O9-1
   1. Décongelez et enduisez une plaque de 24 puits d’une matrice de membrane basale avant de commencer l’expérience. Récupérez et ensemencez les cellules O9-1, ce qui leur permet d’atteindre une confluence de 60 à 80 %.
   2. Diluez les liposomes dans un milieu sans sérum en fonction du volume de puits approprié. Diluer l’ARNi dans un milieu sans sérum jusqu’à la finale. Ajouter des siRNA dilués aux liposomes dilués dans un rapport recommandé par le fabricant. Bien mélanger par pipetage puis incuber.
      note: Suivez le guide du fabricant sur le volume utilisé, le temps et la température d'incubation.
   3. Ajouter un volume approprié de complexe siRNA-lipide aux cellules selon les recommandations du fabricant.
   4. Incuber des cellules pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire standard (37 °C, 5 % CO₂). Effectuer les étapes en aval au besoin (extraire l’ARN, extraire les protéines, coloration, etc.)
      REMARQUE : les temps d’inactivation et les concentrations des siRNA peuvent varier en fonction de l’expérience individuelle.

2. Différenciation des cellules O9-1

1. Différenciation des cellules O9-1 en ostéoblastes
   1. Pour préparer un milieu de différenciation ostéogénique, diluer les éléments suivants dans de l’alpha-MEM (les concentrations finales sont indiquées) : 0,1 μM de dexaméthasone, 100 μg/mL de protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2), 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 mM de b-glycérophosphate, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
   2. Détecter le marqueur ostéoblastique, l’ostéocalcine, dans les ostéoblastes différenciés par immunomarquage, comme le montre la figure 1.
      REMARQUE : La différenciation ostéogénique peut également être évaluée à l’aide d’autres marqueurs d’ostéoblastes ou d’une coloration au rouge d’alizarine ou à la phosphatase alcaline.
2. Différenciation des cellules O9-1 en cellules musculaires lisses
   1. Pour préparer des milieux de différenciation des cellules musculaires lisses, diluer les éléments suivants dans du DMEM (les concentrations finales sont indiquées) : 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 % de FBS.
   2. Améliore la différenciation des cellules musculaires lisses avec coloration par immunofluorescence en utilisant des anticorps contre les marqueurs des cellules musculaires lisses, tels que l’actine des muscles lisses (SMA), illustrée à titre d’exemple sur la figure 2.

Résultats

Figure 1 : Coloration par immunofluorescence de l’ostéocalcine, marqueur de l’ostéocalcine (Ocn), indiquant que les cellules O9-1 ont donné naissance à des cellules ostéoblastiques dans des conditions de différenciation ostéogénique. Les cellules ont été colorées avec l’anticorps Ocn, un marqueur ostéoblastique (vert), et les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Les flè...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
O9-1 lignée cellulaire de la crête neurale crânienne de souris	Millipore Sigma	SCC049
DMEM, glycémie élevée, sans glutamine	Gibco	Référence 11960-044
DMEM, hyperglycémie	Hyclone	SH30243.01
FBS (sérum fœtal bovin)	Millipore Sigma	ES-009-B
Pénicilline - streptomycine	Gibco	Référence 15140-122
L-glutamine 200mM (100X)	Gibco	Référence 25030-081
Trypsine-EDTA 0,25 % dans HBSS	Genesee Scientific	25 à 510
DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) sans calcium ni magnésium	Lonza	17-512F
Acides aminés non essentiels MEM (MEM NEAA) 100X	Gibco	Référence 11140-050
Pyruvate de sodium (100mM)	Gibco	Référence 11360-070
2-Mercaptoéthanol	sigma	M-7522
Facteur de croissance des fibroblastes humains recombinants-basique (rhFGF-basic)	Systèmes de R&D	Référence 233-FB-025
Mitomycine C	Roche	10107409001
Matrice matrigel	Corning	356234
DMSO (diméthylsulfoxyde)	Millipore Sigma	Référence : MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	Référence 13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	Référence 31985-070
Milieu essentiel minimum, alpha 1X avec sels d'Earle, ribonucléosides, désoxyribonucléosides et L-glutamine	Corning	10-022-CV
ARNi ON-TARGETplus Wwtr1	Dharmacon	L-041057
Groupe de non-ciblage ON-TARGETplus	Dharmacon	D-001810
ARNi ON-TARGETplus Yap1	Dharmacon	L-046247
FCS (sérum de veau fœtal)
ITS (insuline-transfertrine-sélénium)
TGF-b3
acide ascorbique
BMP2 (protéine morphogénétique osseuse 2)
dexaméthasone
Supplément B-27