Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement des colonies de cellules progénitrices neurales induites putatives (iNPC)
- Un jour avant de cueillir les colonies d'iNPC, enduire une plaque à 48 puits de laminine : diluer la laminine à 1 μg/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), ajouter 300 μl de la solution sur des plaques et conserver à 4 °C pendant 24 heures. Un jour plus tard, aspirez la laminine des plaques et ajoutez 200 μl de milieux de neuroinduction (1:1 DMEM/F-12 :Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1 % GlutaMAX, 10 ng/ml de facteur inhibiteur de la leucémie humaine, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) dans les puits.
- Lavez une fois avec DPBS les 6 plaques contenant les colonies à cueillir et ajoutez 2 ml de milieu de neuroinduction par puits de 6 plaques de puits. Cueillez les colonies mécaniquement : grattez autour des colonies à l’aide d’une aiguille fine pour vous débarrasser des cellules environnantes ; Réglez le pipeteur de 200 μl sur 50 μl et prélevez les colonies à l’aide des pointes de pipette respectives.
- Transférez une colonie dans un puits d’une plaque à 48 puits recouverte de laminine et générez mécaniquement une suspension cellulaire unique en pipetant 10 fois de haut en bas. Ajouter l’inhibiteur de ROCK Y27632 à une concentration finale de 10 μM dans les cellules.
- Faites pousser les cellules sur la plaque à 48 puits à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 2 jours. Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (environ 3 à 4 jours).
