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1. Préparation des plaques à 24 puits pour les cultures de neurones à haute densité
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes (2-3) la veille de la récolte prévue des embryons.
- Introduisez deux plaques de 24 puits dans le capot de culture cellulaire et ouvrez l’emballage individuel.
- Connectez une aiguille de seringue de 18 g à une seringue en plastique à usage unique de 1 ml.
- Tenez la seringue et dirigez la pointe de l’aiguille à ~1 mm vers la gauche vers le centre du fond du puits. Appliquez une force modérée (~250 g) pour graver le fond du puits (~1 mm de long). Une rainure sera formée et les matières plastiques déplacées formeront un support élevé au-dessus de la surface du puits à fond plat. Gravez une autre rainure parallèle de ~1 mm de long à ~1 mm à droite du centre du fond de la même manière.
- Répétez cette étape pour tous les puits des deux plaques de 24 puits. Les deux plaques de 24 puits utilisées pour la culture à haute densité sont maintenant prêtes à être enrobées de poly-D-lysine (voir l’étape 2.8 ci-dessous).
2. Préparation des lamelles pour les cultures de neurones à faible densité
- Utilisez du verre rond #1 de 12 mm de diamètre.
- Placez 50 lamelles dans une boîte de Pétri en plastique stérile de 100 mm de diamètre et immergez-les dans une solution de 20 ml d’éthanol à 70 %. Placez cette boîte de Pétri sur une plate-forme rotative avec une rotation à vitesse modérée (70 tr/min) pendant une heure. Retirez l’éthanol à 70 %, puis remplacez-le par un nouveau lot d’éthanol à 70 %. Tournez et lavez pendant encore une heure.
- Jetez la solution de nettoyage à l’éthanol à 70 %. Ajouter de l’eau stérile (filtrée à travers une unité de filtration de 0,2 μm). Rincez rigoureusement les lamelles en tournant la boîte de Pétri à la main. Rincez trois fois, en remplaçant à chaque fois par de l’eau fraîche stérile.
- Placez la boîte de Pétri avec les lamelles à l’intérieur d’un capot de culture cellulaire stérile à flux laminaire. Aspirez l’eau de rinçage à travers la conduite d’aspiration et ajoutez 10 ml d’eau stérile filtrée pour immerger les lamelles. Les lamelles doivent être stériles et la surface doit être suffisamment propre pour permettre un revêtement en poly-D-lysine.
- Ouvrez deux plaques à 24 puits de leur emballage individuel et placez-les dans le capot.
- Ouvrez la conduite d’aspiration dans la hotte. Connectez une pointe de pipette de 200 μl à la conduite de vide et utilisez des ciseaux pour couper la pointe afin de créer une plus grande ouverture.
- Utilisez une pince à épiler à pointe fine #5 pour ramasser les lamelles de Pétri, une à la fois, et utilisez la ligne d’aspiration pour sécher complètement la lamelle. Placez ensuite une lamelle dans chacun des puits de la plaque à 24 puits. Les 50 lamelles nettoyées devraient suffire à remplir chacun des puits des deux plaques de 24 puits.
- Diluer la solution mère de poly-D-lysine (1 mg/ml) dans une solution de travail (0,1 mg/ml) avec un tampon de borate (pH 8,5). Pour les quatre plaques à 24 puits (y compris deux plaques à haute densité avec fond dépoli), préparer 30 ml de solution de travail totale.
- Ajouter 300 μl de solution de travail de poly-D-lysine à 0,1 mg/ml dans chaque puits à l’aide de lamelles de verre. Assurez-vous que les lamelles sont complètement immergées dans la solution. Sinon, utilisez la pointe de la pince à épiler #5 pour appuyer les lamelles contre le fond du puits, et utilisez la pointe pour guider la solution de poly-D-lysine afin de couvrir toute la surface des lamelles. Inspectez visuellement toutes les lamelles pour vous assurer qu’aucun air n’a été emprisonné entre la plaque et les lamelles.
- Ajouter 300 μl de solution de travail de poly-D-lysine à 0,1 mg/ml dans chaque puits de la plaque de culture à haute densité avec fond gravé. Tournez à la main pour étaler la solution afin de couvrir tout le fond du puits.
- Retournez les quatre plaques contenant de la poly-D-lysine dans l’incubateur de culture et incubez O/N.
3. Lavage et préconditionnement des plaques pour la culture
REMARQUE : Les étapes suivantes (3-5) sont effectuées le jour du prélèvement des tissus.
- Après l’incubation ou l’enrobage des lamelles et des plaques à 24 puits O/N, amener les quatre plaques (deux avec lamelles donneuses, deux plaques accepteurs à haute densité avec fond en plastique gravé) dans le capot de culture. Utilisez la conduite de vide pour retirer la solution de poly-D-lysine.
- Immédiatement après le retrait de la solution de poly-D-lysine, ajoutez ~1 ml d’eau stérile dans chaque puits à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Une fois que tous les puits sont remplis d’eau, laissez reposer pendant 10 min. Retirez l’eau sous vide, puis ajoutez 300 μl de fluide de lavage dans chaque puits pour couvrir le fond du puits (avec ou sans lamelles en verre). Ne laissez pas le revêtement de poly-D-lysine se dessécher.
- Remettez les quatre plaques dans l’incubateur de cellules. Les plaques sont prêtes à l’emploi une fois que les neurones de l’hippocampe dispersés sont préparés.
4. Placage des neurones et co-culture à long terme
- Introduisez les deux plaques à 24 puits avec des fonds gravés pour les neurones à haute densité dans le capot de culture cellulaire. Retirer le fluide de préconditionnement de 300 μl par le vide. Plaque 0,6 ml de suspensions cellulaires à haute densité à 250 000 neurones/ml.
- Introduisez les deux autres plaques de 24 puits avec lamelles dans la hotte de culture et retirez le milieu de préconditionnement de 300 μl par le vide. Plaques de 0,6 ml de suspensions cellulaires à faible densité à 10 000 neurones/ml sur les lamelles à l’intérieur des deux plaques à 24 puits.
- Remettez les quatre plaques de 24 puits dans l’incubateur. Laisser reposer pendant 2 heures.
- Retournez les lamelles de faible densité avec des neurones adhérents à la culture à haute densité. Assurez-vous que les neurones sont face à face (c’est-à-dire qu’ils ne sont pas séparés par la lamelle de verre). Remettez ensuite les deux plaques avec co-culture dans l’incubateur.
5. Maintien de la co-culture
- Nourrir les co-cultures en ajoutant 300 μl de milieu d’alimentation frais (voir Matériels) le jour in vitro (DIV) 5. Il n’est pas nécessaire de prélever 50 % du milieu de culture complet d’origine, comme l’ont rapporté de nombreuses autres études. Le milieu d’alimentation contient également 15 μM de cytosine arabinoside (Ara-C, pour obtenir une concentration finale de 5 μM) afin de minimiser les risques de contamination et de prolifération gliales.
- Après cette première alimentation, ajoutez 300 μl de milieu d’alimentation frais sans Ara-C dans le puits chaque semaine. Si la culture est conservée pendant plus d’un mois, remplacer la moitié du milieu par du milieu frais chaque semaine au-delà d’un mois (avec la première moitié du milieu de remplacement à DIV33). Morphologiquement, les neurones à haute densité et à faible densité semblent en bonne santé jusqu’à trois mois (la plus longue période observée par les expérimentateurs).