Technique de génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Résumé

Source : Mao, X., et al. Différenciation neuronale à partir de cellules souches embryonnaires de souris in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une méthode de génération in vitro de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de cellules souches embryonnaires de souris (mESC). Les CSEm sont cultivées en suspension pour former des corps embryoïdes (EB), qui sont ensuite guidés pour se différencier en NPC via un traitement à l’acide rétinoïque dans une culture adhérente.

Protocole

1. Culture de cellules souches embryonnaires de souris

1. Préparez des plats ou des assiettes de culture cellulaire enrobés de gélatine à 0,1 %.
   1. Ajouter 2 ml de gélatine stérilisée à 0,1 % (0,1 % p/v dans l’eau) dans des boîtes de culture cellulaire de 60 mm. Basculez doucement pour assurer un revêtement uniforme des boîtes de culture cellulaire.
   2. Placez les plats dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C et laissez enrober pendant 1 h.
   3. Retirez la solution de gélatine à 0,1 % avant d’ensemencer les cellules.
      note: Après avoir retiré la gélatine, il n’est pas nécessaire de sécher ou de laver la vaisselle enduite.
2. Culture de cellules souches embryonnaires de souris (A2lox et 129)
   1. Incuber des cellules mESC (A2lox et 129) dans des boîtes de culture cellulaire de 60 mm recouvertes de gélatine à 0,1 % dans un milieu de croissance mESC à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂, respectivement. Le milieu de croissance mESC se compose à 85 % de milieu Eagle modifié de Dulbecco et d'un mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12), de 15 % de remplacement sérique knock-out (KSR), de 0,1 mM de β-mercaptoéthanol (2ME), de 2 mM de GlutaMAX, de 1 % d'acides aminés non essentiels (NEAA), de 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), de 1000 U/mL de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), de 10 nM CHIR-99021 (inhibiteur de GSK-3) et de 0,33 nM PD0325901 (inhibiteur de MEK).
      ATTENTION : Le β-mercaptoéthanol est inflammable et présente une toxicité par inhalation. Tenir à l’écart des sources d’incendie et porter un masque pour éviter l’inhalation lors de l’utilisation.
   2. Changez le milieu de croissance mESC tous les jours pour une meilleure croissance de A2lox et 129.
   3. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, retirer le milieu et ajouter 1 mL de trypsine à 0,1 % dans la boîte. Balancez doucement pendant 30 secondes pour assurer une couverture uniforme de trypsine sur toutes les cellules.
   4. Laissez les cellules pendant environ 1 minute pour trypsiniser, puis retirez la trypsine à l’aide d’une pipette de 1 ml.
   5. Ajouter 2 mL de milieu de croissance mESC dans la boîte, pipeter de haut en bas plusieurs fois pour former une suspension unicellulaire.
   6. Comptez la densité des cellules dans la suspension aussi précisément que possible à l’aide d’un hémocytomètre.
   7. Divisez les cellules en 7 groupes et induisez la différenciation à l’aide de différents protocoles présentés dans le tableau 1.

2. Différenciation des CSEm en NPC

1. Préparez des plaques de culture cellulaire ou des lamelles enrobées de gélatine à 0,1 %.
   1. Avant utilisation, préparez des plaques ou des lamelles à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 % comme à l’étape 1.1.
2. Différenciation (tableau 1)
   1. Ajouter 1,5 x 10⁶ mESC dans une boîte bactérienne non adhésive dans 10 mL de milieu de différenciation basale I pour permettre la formation d’un corps embryoïde à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
   2. Après 2 jours, transférez les agrégats cellulaires dans des tubes à centrifuger de 15 ml et laissez-les se déposer par gravité.
   3. Retirer le surnageant et ajouter 10 mL de milieu de différenciation basal frais I pour remettre en suspension les corps embryoïdes. Replantez-les dans un nouveau plat bactérien non adhésif et laissez la différenciation pendant encore 2 jours.
   4. Vérifiez la formation des corps embryoïdes au microscope (Figure 1A).
   5. Prélever les corps embryoïdes comme décrit aux étapes 2.2.2-2.2.3. Ensemencer environ 50 corps embryoïdes dans 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %.
   6. Préparez 1 mM d’acide rétinoïque (AR) tout-trans (dans du DMSO) et conservez-le à l’abri de la lumière dans un congélateur à -80 °C après l’emballage secondaire.
      note: L’AR est instable, et il faut veiller à le garder à l’abri de la lumière et à réduire le contact avec l’air pendant la préparation du stock d’AR.
   7. Pour l’induction de l’AR, ajouter 2 μL de stock d’AR dans chaque puits pour obtenir une concentration finale de 1 μM.
   8. Placez la plaque dans l’incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C et différenciez pendant 4 jours supplémentaires.
   9. Changez la totalité des 2 mL de milieu de différenciation basale I (avec 1 μM AR) tous les 2 jours.

Tableau 1 : Détails du protocole utilisé pour la différenciation.

protocole	média
Formation des corps embryoïdes en 4 jours + induction de la PR en 4 jours	Milieu de différenciation basale : DMEM/F12 +15 %FBS + 1 %NEAA+0,1 mM 2ME+ 1 %P/S

Résultats

Figure 1 : La morphologie des corps embryoïdes. (A) Corps embryoïdes cultivés pendant 4 jours. (B) Corps embryoïdes cultivés pendant 2 jours.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supplément de B-27 (50X), sans sérum	Gibco	17504044	stocké à -20 °C et à l’abri de la lumière
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stocké à -20 °C
Lamelles	nid	801007
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30084.03	conservé à -20 °C, éviter les congélations et décongélations répétées
gélatine	Gibco	CM0635B	conservé à température ambiante
Supplément GlutaMAX	Gibco	35050061	stocké à 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stocké à 4 °C
Remplacement du sérum KnockOut	Gibco	10828028	conservé à -20 °C, éviter les congélations et décongélations répétées
MEM Solution d’acides aminés non essentiels	Gibco	11140076	stocké à 4 °C
Supplément N-2 (100X)	Gibco	17502048	stocké à -20 °C et à l’abri de la lumière
Milieu neurobasal	Gibco	21103049	stocké à 4 °C
Saline tamponnée au phosphate (1X)	HyClone	SH30256,01 milliard	stocké à 4 °C
Solution de pénicilline/streptomycine	HyClone	SV30010	stocké à 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stocké à -20 °C
Acide rétinoïque	sigma	R2625	conservé à -80 °C et à l’abri de la lumière
Souche 129 : Cellules souches embryonnaires de souris	Cyagen	MUAES-01001	Maintenu dans un système de culture sans mangeoire
Trypsine à 0,25 % (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stocké à 4 °C
2-Mercaptoéthanol	Gibco	21985023	conservé à 4 °C et à l’abri de la lumière
Boîte de culture cellulaire de 60 mm	Corning	430166
Tube à centrifuger de 15 ml	Nunc	Référence 339650