Différenciation des cellules progénitrices neurales en neurones

Résumé

Source : Mao, X., et al. Différenciation neuronale à partir de cellules souches embryonnaires de souris in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo présentait une méthode de culture cellulaire pour différencier les cellules progénitrices neurales en neurones. En incubant des cellules dans un milieu riche en nutriments complété par des facteurs de croissance, les cellules progénitrices ont mûri en neurones avec des axones et des dendrites développés. Un agent stabilisant assurait la viabilité cellulaire et protégeait contre les dommages oxydatifs tout au long du processus de différenciation.

Protocole

1. Différenciation des NPC en neurones (Phase II)

1. Ensemencer environ 5 x 10⁵ cellules souches embryonnaires de souris ou des dérivés de CSEm dans un rayon de 2 mL du milieu de différenciation basale I par puits sur les plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Divisez au hasard les dérivés de mESC en 3 groupes, comme le protocole de phase II 1, le protocole 2 et le protocole 3, respectivement.
2. Placez la plaque dans l’incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pour permettre la fixation pendant 6 h. Lavez-les deux fois avec 2 ml de PBS.
3. Ajouter 2 mL de milieu de différenciation basale I, de milieu N2B27 I et de milieu N2B27 II (tableau 1), respectivement, à chacun des puits des groupes ci-dessus.
4. Placez les plaques dans l’incubateur et laissez-les se différencier pendant encore 10 jours. Changez le support correspondant tous les 2 jours.
5. Vérifiez l’état de différenciation et enregistrez les changements morphologiques comme mentionné à l’étape 3.
6. Au jour 18, évaluez la génération de neurones (β-tubuline III positive) et déterminez l’efficacité de différenciation des 3 protocoles utilisés à l’étape 4.

Résultats

Tableau 1 : Détails des 3 protocoles utilisés dans la différenciation de phase II.

Phase de différenciation II (10d)
	protocole	média
Protocole 1	Différenciation naturelle : Avec le milieu de différenciation basale, je ne

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-β-tubuline III produit chez le lapin	Sigma Aldrich	Réf. T2200	conservé à -80 °C, éviter la congélation et la décongélation répétées
Supplément de B-27 (50X), sans sérum	Gibco	17504044	stocké à -20 °C et à l’abri de la lumière
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023,01 milliard	stocké à 4 °C
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30084.03	conservé à -20 °C, éviter les congélations et décongélations répétées
Microscopie à fluorescence	Olympe	CKX53
gélatine	Gibco	CM0635B	conservé à température ambiante
Supplément GlutaMAX	Gibco	35050061	stocké à 4 °C
Tampon de dilution d’anticorps primaires de coloration Immunol	Beyotime	Réf. P0103	stocké à 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stocké à 4 °C
MEM Solution d’acides aminés non essentiels	Gibco	11140076	stocké à 4 °C
Supplément N-2 (100X)	Gibco	17502048	stocké à -20 °C et à l’abri de la lumière
Sérum de chèvre normal	Jackson	Référence : 005-000-121	stocké à -20 °C
Milieu neurobasal	Gibco	21103049	stocké à 4 °C
Plat bactérien non adhésif	Corning	Référence 3262
Saline tamponnée au phosphate (1X)	HyClone	SH30256,01 milliard	stocké à 4 °C
Solution de pénicilline/streptomycine	HyClone	SV30010	stocké à 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stocké à -20 °C
Acide rétinoïque	sigma	R2625	conservé à -80 °C et à l’abri de la lumière
Souche 129 : Cellules souches embryonnaires de souris	Cyagen	MUAES-01001	Maintenu dans un système de culture sans mangeoire
2-Mercaptoéthanol	Gibco	21985023	conservé à 4 °C et à l’abri de la lumière
4 % de paraformaldéhyde	Beyotime	Réf. P0098	stocké à -20 °C
6 - plaque de puits	Corning	Référence 3516
Boîte de culture cellulaire de 60 mm	Corning	430166
Tube à centrifuger de 15 ml	Nunc	Référence 339650