Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.
1. Dissociation des ganglions sensoriels
- Pipeter 500 μl de solution de dissociation des ganglions (GaDS) (tableau 1), en laissant les ganglions dans le tube. Lavez les ganglions une fois en ajoutant 1 ml de solution tampon de phosphate (PBS), attendez que les ganglions se déposent au fond du tube, puis pipetez le PBS.
- Ajouter 1 ml de GaDS et 22 μl d’enzyme de digestion (collagénase I/II et mélange de protéase, 2,5 mg/ml dans de l’eau) dans chaque tube.
- Ajoutez 20 μl de Fast Blue (5,26 mM) dans le tube de contrôle positif.
- Placez les tubes dans un bain-marie ou un bloc chauffant réglé à 37 °C.
- Toutes les 15 minutes, secouez brièvement les tubes et effleurez-les pour vous assurer que les ganglions sont recouverts par la solution.
note: Le temps de digestion des ganglions dépend de l’âge de l’enzyme de digestion. Dans le mois suivant la dissolution de l’enzyme de digestion, digérer pendant 30 min ; Dans un délai de 2 à 6 mois, digérer pendant 45 min. Si l’enzyme a plus de six mois, digérez les ganglions pendant 60 min.
- Pendant la digestion des ganglions, préparez les gradients de densité à l’aide d’une solution de particules (particules de silice colloïdale enrobées de polyvinylpyrrolidone).
- Mélanger une solution de particules à 12 % dans du GaDS, 500 μl par échantillon.
- Mélanger une solution de particules à 28 % dans du GaDS, 500 μl par échantillon.
- Ajouter lentement et soigneusement une solution de 400 μl de densité 12 % sur une solution de 400 μl de densité 28 % dans un tube frais de 1,5 ml pour chaque échantillon. Ne laissez pas les deux couches se mélanger. Deux couches distinctes doivent être visibles dans le tube, l’une plus foncée que l’autre.
- Après le temps de digestion approprié, retirez le GaDS avec l’enzyme de digestion et lavez les ganglions deux fois avec 1 ml de PBS. Ajoutez 200 μl de GaDS frais dans chaque tube.
- Utilisez une pipette de 200 μl, réglée sur un volume de 100 μl, et pipetez les ganglions de haut en bas plusieurs fois pour briser les cellules. Répétez l’opération jusqu’à ce qu’aucun morceau de tissu intact ne soit visible. Évitez de créer des bulles dans la solution.
- Faites passer les cellules dissociées à travers une crépine de 70 μm.
- Ajoutez encore 100 μl de GaDS dans le tube de dissociation d’origine pour ramasser les cellules résiduelles restantes et faire passer la solution supplémentaire à travers la crépine cellulaire. À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, récupérez tout liquide contenant des cellules qui est passé à travers la crépine et s’est accroché au grillage. Le volume final des cellules en suspension dans le GaDS est de 300 μl.
- Superposez soigneusement les 300 μl de cellules sur le gradient de densité précédemment établi. Évitez les bulles et le mélange des cellules avec les couches de densité.
- Centrifugeuse pendant 10 min à 2 900 x g à RT.
- Une fois la centrifugation terminée, retirez et jetez soigneusement la couche supérieure de 700 μl. Cette couche contient la majorité des débris cellulaires qui, autrement, interféreraient avec le tri des cellules.
- Ajoutez 700 μl de GaDS frais dans la solution contenant la cellule restante et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger.
- 18. Centrifuger pendant 15 min à 2 900 x g pour les cellules de granulés.
- 19. Une fois la centrifugation terminée, retirez et jetez soigneusement le surnageant, en laissant la pastille cellulaire.
- Remettez en suspension la pastille de cellule dans 200 à 300 μl de GaDS en pipetant plusieurs fois de haut en bas avec une pipette de 1 000 μl réglée à 200 μl. Mettez les échantillons sur de la glace.
Table 1. Mélange réactif pour solution de dissociation des ganglions (GaDS).
| ingrédient | quantité |
| DMEM/f12 avancé | 9,5 ml |
| glutamine | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| Supplément N2 | 100 μl |
| B27 (sans vitamine A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
