Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
REMARQUE : Le protocole ci-dessous décrit la méthode de préparation et de culture pour l’incubation à long terme et l’imagerie intermittente de coupes d’hippocampe. Une seule tranche d’hippocampe est fixée à une lamelle photodécoupée spécialement préparée à l’aide d’un caillot de plasma, puis les lamelles sont scellées sur le côté plat d’un tube de rouleau percé, qui est maintenu dans un incubateur à rouleaux.
1. Préparation du support de tube à rouleaux
- Utilisez le modèle illustré à la figure 1A, imprimé à la taille indiquée sur la barre d’échelle. À l’aide d’un clou, percez de petits trous (assez grands pour un marqueur à pointe fine) dans le gabarit centré sur les trous.
- Placez le gabarit au fond d’une boîte de culture tissulaire de 15 cm (diamètre nominal de 14 cm) et marquez la position des trous. Répétez cette opération sur un deuxième plat.
- Avec des forets conçus pour être utilisés sur du plastique, percez six trous de 1,5 cm de diamètre sur chaque plat en un réseau hexagonal (4,8 cm de centre à centre) avec des centres de trous à 2,5 cm du bord du plat. Percez trois trous (3 mm de diamètre) à 12 mm du bord qui sont placés à égale distance entre deux des trous les plus grands, comme illustré à la figure 1A.
- Avec le fond de chaque plat face à face, placez une vis à métaux de 2,5 pouces de long (3/16 de pouce de diamètre) avec une rondelle plate dans l’un des petits trous suivie d’une deuxième rondelle plate, d’un morceau de tube en polyéthylène (entretoise, 4,7 cm), d’une autre rondelle plate, d’une deuxième boîte de culture tissulaire, d’une autre rondelle plate, d’une rondelle de blocage, et une noix.
- Répétez l’étape 1.4 sur les deux autres vis mécaniques et serrez uniquement sans serrer jusqu’à ce que toutes les vis mécaniques soient en place. Serrez ensuite fermement les écrous.
- Enfoncez les œillets (5/16 po d’épaisseur, 5/8 po de diamètre) dans les trous du plat inférieur pour obtenir le dernier support de tube à rouleau (Figure 1B ; illustré avec deux tubes en place). Placez un autocollant sur chaque support avec un numéro unique.
2. Préparation des tubes à rouleaux et des lamelles
- Fabrication du gabarit pour percer le trou dans les tubes à rouleaux
- Percez un trou de 1,5 cm et de 8 cm de profondeur au centre d’un bloc de bois de 2 x 4 x 5,5 pouces à un angle tel que le côté plat du tube du rouleau soit presque parallèle au bloc lorsqu’il est inséré (Figure 2A).
- Agrandissez le trou à l’aide d’une lime à bois ronde pour élargir et effiler le trou afin de permettre l’insertion du tube (les tubes à rouleaux ont un diamètre légèrement plus grand près de l’extrémité du capuchon) (figure 2B).
- Percez un trou vertical de 1,5 cm de diamètre, à 5,5 cm du côté du bloc et centré sur le trou latéral (Figure 2C).
- Lorsque le trou latéral est suffisamment effilé, insérez un tube de rouleau marqué à l’endroit souhaité pour centrer le trou de la tranche et positionnez le tube de manière à ce que l’endroit marqué soit centré dans le trou vertical de 1,5 cm.
- Retirez le tube et mesurez la distance entre l’endroit et l’extrémité du tube. Marquez cette distance à partir du centre du trou dans le gabarit et insérez un clou pour fournir une butée afin de positionner correctement le tube pour le perçage (flèche sur la figure 2C).
- Utilisez une scie à métaux pour couper le clou au ras de la surface du bloc de bois afin d’éviter les blessures.
- Ajoutez des clips à ressort au bas du gabarit s’il y a une perceuse à colonne avec des fentes qui permettent de l’ancrer (Figure 2D flèche noire). Sinon, utilisez des pinces en C pour maintenir le gabarit en toute sécurité sur la perceuse à colonne.
- À l’aide du gabarit décrit ci-dessus, pour tenir et positionner un tube de culture en plastique de 11 cm à parois plates avec le côté plat vers le haut (Figure 2A), percez un trou de 6 mm de diamètre avec le centre à 1,0 cm du bas et centré entre les côtés du tube.
note: Un foret conçu pour le plastique doit être utilisé.
- À l’aide d’un outil d’ébavurage pivotant, lissez les bords du trou (Figure 2E) et faites 4 rainures sur le bord intérieur du trou (Figure 2E, encadré) pour faciliter le drainage du trou pendant la rotation.
- À l’aide d’un poinçon de 12 mm, découpez des disques de 12 mm de diamètre dans des feuilles de caoutchouc de silicone adhésives double face non toxiques. À l’aide d’une perforatrice à papier standard à un trou (6 mm de diamètre), faites un trou au centre de chaque disque.
- Rincez les tubes percés avec de l’éthanol à 70 %, faites-les sécher à l’air libre dans une enceinte de sécurité biologique et stérilisez les tubes et les disques adhésifs perforés pendant 40 min sous la lampe ultraviolette (UV) (30 W à une distance moyenne de 70 cm) dans l’enceinte de sécurité biologique.
- Repositionnez les tubes et les disques après 20 minutes afin que toutes les surfaces exposées soient stérilisées. Dans des conditions stériles, décollez le support blanc d’un disque adhésif et fixez le caoutchouc de silicone à l’extérieur d’un tube, en alignant les trous (Figure 2F).
prudence: Pour éviter l’exposition aux UV, portez des lunettes de protection et fermez l’armoire avant d’allumer la lampe UV.
- Des lamelles en verre allemand propres de 12 mm de diamètre, photodécoupées (100 carrés centraux numérotés de 1 mm). Tenez doucement les lamelles avec une pince et trempez-les dans de l’éthanol absolu, puis de l’eau, puis de l’éthanol absolu à nouveau, et enfin trempez les lamelles dans une flamme pour brûler l’éthanol. Laissez refroidir les lamelles.
- En tenant les lamelles à l’aide d’une pince, trempez-les dans du 3-aminopropyltriéthoxysilane à 2 % dans de l’acétone pendant 10 s. Rincez les lamelles à l’eau ultra-pure et laissez-les sécher à l’air.
- Placez les lamelles sur du papier filtre stérile à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique et allumez la lumière UV. Exposer chaque côté des lamelles pendant 20 min.
prudence: Pour éviter l’exposition aux UV, portez des lunettes de protection et fermez l’armoire avant d’allumer la lampe UV.
3. Préparation de la tranche d’hippocampe
- Avant de commencer la dissection, préparez des moitiés de lames de rasoir à double tranchant pour le hachoir à tissus. Pliez soigneusement les lames dans le sens de la longueur avec les doigts et cassez-les en deux.
- Rincez les moitiés de lame à l’acétone à l’aide d’un coton-tige pour les nettoyer, puis rincez-les à l’éthanol absolu et séchez-les à l’air. Avant de monter une demi-lame sur le hachoir à tissus, stérilisez-le par rinçage à l’éthanol à 70 %.
- Suivez les protocoles approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’établissement ; après une anesthésie à l’isoflurane, euthanasiez une souris ou un raton âgé de 4 à 7 jours par décapitation et retirez la tête avec des ciseaux ou une guillotine.
note: Le protocole de culture par tranches de cerveau est indépendant de la souche ou du génotype de la souris ou du rat. De nombreuses lignées de souris transgéniques avec des antécédents génétiques différents ont été utilisées.
- Rincez la tête avec de l’éthanol à 70 % et placez-la dans une boîte de Pétri de 60 mm. Jusqu’au montage final de la tranche de cerveau sur le tube du rouleau, toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.
- À l’aide d’une lame chirurgicale #21, faites une coupe sagittale à travers la peau et le crâne. À l’aide d’une pince Dumont #5, retirez la peau et le crâne pour exposer le cerveau.
- À l’aide d’une pince fermée, extrayez doucement tout le cerveau, en le libérant en le pinçant avec la pince à travers le tronc cérébral derrière le cervelet. Placez le cerveau dans une boîte stérile de 60 mm contenant une solution saline équilibrée de Gey à 4 °C/glucose à 0,5 % (GBSS/glucose).
- À l’aide d’un microscope de dissection pour visualiser le cerveau (figure 3A), placez le côté dorsal du cerveau vers le haut et coupez le tiers avant du cerveau et le cervelet à l’aide d’une lame chirurgicale (figure 3B).
- À l’aide d’une pince, tenez le cerveau coupé côté postérieur vers le haut et le côté ventral contre le côté de la boîte de Pétri pour plus de stabilité. Retirez doucement les méninges autour de la ligne médiane sagittale et retirez le tissu du mésencéphale à l’aide d’une pince Dumont #5 à pointe fine (Figure 3C, cercle pointillé).
- Faites deux entailles sur le côté du cerveau pour l’ouvrir (Figure 3C, lignes pointillées). Une fois que le cerveau est placé côté dorsal vers le bas et ouvert, la fissure de l’hippocampe devrait être visible (Figure 3D, flèche).
- Transférez le cerveau ouvert étalé dans un morceau de film plastique de polychlorotrifluoroéthylène et positionnez-le pour le tranchage sur la scène d’un hachoir à tissus. Mouillez la lame avec du GBSS/glucose et hachez l’hippocampe en tranches de ~300 μm d’épaisseur.
- À l’aide d’une pipette de transfert, rincer la cervelle tranchée du film plastique dans une boîte fraîche de 60 mm contenant du GBSS/glucose (figure 3E). Pincez doucement et taquinez, à l’aide d’une pince à pointe fine, les méninges restantes et d’autres tissus non hippocampiques (figure 3F) des tranches (figures 3G, H).
4. Placage des tranches
- Une fois les tranches obtenues, placez 2 μL de plasma de poulet au centre du côté photodécoupé d’une lamelle préparée. Répartissez légèrement le plasma pour obtenir un point de 3-4 mm de diamètre.
note: La face photodécoupée est la face supérieure de la lamelle lorsqu’elle est observée à travers un microscope de dissection de sorte que les numéros sont correctement orientés.
- Transférez 1 tranche de cerveau à l’aide d’une spatule stérile à pointe étroite (figure 4A) sur la tache de plasma (figure 4B). À l’aide d’une pince fermée, maintenez la tranche sur la pointe de la spatule tout en soulevant la tranche du GBSS/glucose.
- Touchez la spatule au point de plasma sur la lamelle et, à l’aide d’une pince fermée, poussez la tranche sur la lamelle.
- Mélangez 2,5 μL de plasma avec 2,5 μL de thrombine dans un tube séparé. Placez rapidement 2,5 μL de ce mélange sur et autour de la tranche et faites une pipette de haut en bas doucement pour la mélanger (Figure 4B).
note: Le plasma coagulera en 10 à 15 s, ce qui doit être fait rapidement. Si l’adhérence de la tranche est un problème, mélangez 5 μL de plasma avec 5 μL de thrombine et utilisez 4 à 5 μL sur la tranche, en en retirant une partie après le mélange de sorte que la tranche repose à plat sur la lamelle.
- Retirez le revêtement en plastique transparent de la face exposée de l’adhésif en caoutchouc de silicone précédemment fixé à un tube roulant et placez la lamelle avec la tranche de cerveau sur l’adhésif en alignant la tranche dans le trou (Figure 4C).
- Pour assurer l’adhérence, appliquez une pression douce et uniforme sur la lamelle avec le pouce en appuyant uniformément sur la lamelle et en la maintenant pendant environ 1 minute tout en la transférant dans l’enceinte de sécurité biologique.
- Dans une enceinte de sécurité biologique, ajouter 0,8 mL de milieu de culture Neurobasal A complet (tableau des matériaux) dans chaque tube (figure 4D).
- Faites passer un mélange d’air à 5 % de CO2/95 % à travers une pipette Pasteur stérile bouchée de coton maintenue solidement par une pince. Rincez le tube du rouleau avec le mélange gazeux et bouchez rapidement le tube lorsqu’il est retiré de la pipette.
- Étiquetez les tubes avec le numéro de la tranche et le numéro de la grille. Insérez les tubes dans un support à roulettes, en vous assurant qu’ils sont géométriquement équilibrés. S’il y a un nombre impair de tubes, ajoutez des tubes pour équilibrer.
- Placez les grilles dans un incubateur à roulettes à 35 °C avec des rouleaux tournant la grille à rouleaux à environ 10-13 tours par heure (RPH) (Figure 4E). Pour maintenir le milieu au fond des tubes, inclinez l’incubateur vers l’arrière d’environ 5° en soulevant sa face avant sur une planche.
