1. Normalisation des cultures neuronales à l’aide de dispositifs microfluidiques : assemblage de dispositifs
- Sélectionnez un dispositif microfluidique adapté à l’expérience souhaitée. Pour connecter des neurones au sein d’une même population, utilisez les dispositifs neurologiques (figure 1), et pour connecter des neurones dans différentes populations, utilisez les dispositifs de co-culture (figure 2).
- Nettoyez et préparez le nombre désiré de lamelles stériles ou de plats à fond de verre. Pour de meilleurs résultats sur les surfaces en plastique, utilisez des plats de 35 mm, sur du verre, des lamelles de 25 mm ou des plats à fond en verre de 35 mm. Sélectionnez l’épaisseur du verre en fonction du système d’imagerie, par exemple 0,15 mm.
- Enduire la vaisselle ou les lamelles avec 0,5 à 1 mL de 100 μg/mL de PDL pendant 2 h ou toute la nuit à température ambiante.
note: Le protocole peut être interrompu ici et repris le lendemain si vous le souhaitez. De plus, les boîtes peuvent être recouvertes de PDL diluée par un tampon de borate, de poly-L-lysine (PLL), de laminine ou de toute autre molécule d’adhésion cellulaire.
- Lavez la vaisselle deux fois avec de l’eau (n’utilisez pas de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) car les cristaux de sel peuvent bloquer les canaux), retirez tout le liquide et laissez-le sécher dans un environnement stérile tel qu’une enceinte de biosécurité pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce que la surface soit complètement sèche.
note: Veillez à ce que les lamelles soient absolument sèches, car tout liquide restant interférera avec l’adhérence des systèmes microfluidiques.
- Placez les dispositifs microfluidiques avec des motifs orientés vers le haut sous la lumière UV dans un environnement stérile (enceinte de biosécurité) pendant 10 min. Assurez-vous de suivre les procédures stériles lorsque vous travaillez dans l’enceinte de biosécurité10.
- À l’aide d’une pince à épiler, placez un dispositif microfluidique avec un motif vers le bas en contact avec la lamelle/le plat propre. À l’aide de la pince à épiler, appuyez doucement sur l’appareil afin qu’il adhère au verre.
note: La transparence de la région collée sera visible lorsque vous regardez à contre-jour. Assurez-vous que tous les coins sont en contact avec le verre. Faites cela pour tous les dispositifs microfluidiques. Voir la figure 1a.
- Pour remplir le dispositif à population unique avec du milieu, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 50 μL de milieu cellulaire complet complété par du B-27 sans sérum (rapport de volume de 1:50) et 500 μg/mL de pénicilline/streptomycine/glutamine (collectivement appelés NBM) dans le puits supérieur droit, puis ajoutez 50 μL supplémentaires dans le puits situé en diagonale par rapport à celui-ci. Faites-le pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s’écoule entre les puits. Ensuite, ajoutez 50 μL de fluide dans les deux puits restants. Voir la figure 3a.
- Pour remplir le dispositif à population multiple avec du fluide, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 30 μL de NBM complet dans les puits de droite, reportez-vous à la figure 2a. Faites-le pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s’écoule entre les puits. Ensuite, ajoutez 50 μL de fluide dans les quatre puits restants.
- Placez les appareils dans une assiette plus grande avec un plat ouvert avec de l’eau autoclavée (chambre humide) et placez-les dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité) pendant 1 à 2 h pendant la préparation de la culture cellulaire. Voir la figure 3b.
2. Placage des neurones dans les systèmes microfluidiques
- En suivant un protocole, obtenir des neurones hippocampiques ou corticaux dissociés à partir d’embryons de rats Sprague Dawley (quel que soit leur sexe).
- Mettre en suspension les neurones embryonnaires dans le NBM à une concentration de 1 à 2 millions de neurones/mL. Vérifiez les concentrations cellulaires au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et en suivant la référence 8. Ajustez la concentration cellulaire en fonction de la densité cellulaire souhaitée. Pour augmenter les chances d’obtenir des axones uniques de l’hippocampe par canal, mettez en plaque 10 000 neurones par appareil. Pour avoir plusieurs axones dans le même canal, mettez en plaque 60 000 neurones par appareil.
Remarque : Ces chiffres varient en fonction du type neuronal utilisé.
- Retirez le fluide des dispositifs microfluidiques sans vider les puits. Laissez environ 5 μL dans chacun.
- Pour plaquer les cellules dans le dispositif à population unique, ajoutez 50 μL de NBM dans le puits inférieur droit. À ce stade, le milieu s’écoule de lui-même pour remplir l’autre puits inférieur. Ajouter 20 μL de la solution de la cellule concentrée dans le puits supérieur droit du dispositif microfluidique, comme indiqué à la figure 1b.
- Pour plaquer les cellules dans le dispositif à population multiple, ajoutez 20 μL de la solution cellulaire concentrée dans chacun des puits de droite de la figure 2a.
- Vérifiez au microscope si des cellules se trouvent à l’intérieur des chambres et placez les appareils dans l’incubateur pendant 15 à 30 minutes pour favoriser la fixation des cellules au substrat.
- Vérifiez au microscope s’il y a suffisamment de cellules dans les chambres. Si vous en avez besoin, répétez les étapes 2.4 et 2.5.
- Ajouter 50 μL de NBM dans les 2 puits supérieurs du dispositif à population unique et 20 μL de NBM dans le même puits que les cellules ont été injectées dans le dispositif à population multiple. Le média dépasse légèrement pour former un ménisque positif, donnant aux puits un aspect de muffin. Encore une fois, voir la figure 3a.
- Maintenez les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
3. Maintenir les cultures neuronales
- Retirer le NBM (environ 30 μL à l’aide d’une pipette) des cellules et appliquer du NBM préchauffé le lendemain de leur introduction dans les dispositifs (c’est-à-dire 1 jour après l’étape 2).
- Vérifiez tous les 2 jours s’il y a suffisamment de fluide dans chaque canal. Si le dessus du muffin est bas, il suffit d’ajouter plus de moyen dans les puits supérieurs.
- Cultiver des cellules pendant au moins 7 jours avant de retirer les dispositifs microfluidiques. Les cellules peuvent survivre dans ces dispositifs pendant plusieurs semaines. Retirez les dispositifs 1 à 2 jours avant que les expériences ne soient effectuées sur les échantillons.
4. Retrait des dispositifs microfluidiques
- 1 à 2 jours avant de retirer les dispositifs microfluidiques, ajouter 2 mL de MNB préchauffé à 37 °C dans chaque plat d’échantillon, en inondant les chambres, et maintenir les dispositifs dans l’incubateur.
- À l’aide d’une pince à épiler stérile et d’une pointe, retirez les dispositifs microfluidiques des lamelles, laissant ainsi une configuration structurée de neurones. Utilisez l’embout pour maintenir la lamelle en place et la pince à épiler pour fixer le bord de l’appareil dans le coin inférieur gauche du puits. Appliquez délicatement une torsion en soulevant l’appareil à l’aide de la pince à épiler pour qu’il se décolle de la lamelle. Voir la figure 3c-3d.
- Tous les 2-3 jours, remplacez la moitié du NBM jusqu’à ce que l’échantillon soit utilisé pour des expériences.
- Avant d’effectuer des expériences de recâblage sur l’échantillon, vérifiez que les neurites dans les canaux du dispositif à population unique et les populations neuronales dans le dispositif à population multiple sont isolées en examinant les espaces entre eux au microscope pour s’assurer qu’il n’y a pas de filaments reliant les populations neuronales.
5. Préparation des billes enrobées de PDL
- Ajouter 2 gouttes de 50 μL de billes de polystyrène de 4, 10 ou 20 μm diluées dans de l’eau (1:500) à 1 mL de PDL (100 μg/mL). Laisser reposer au moins 2 h à température ambiante.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici et repris le lendemain.
- Centrifuger la solution à 8 820 x g pendant 1 min. Retirer délicatement le surnageant sans déranger les billes accumulées au fond du récipient.
- Lavez les billes deux fois avec 1 mL de solution stérile de 10 mM HEPES pH 8,4.
- Remettre en suspension les billes enrobées de PDL dans 200 mL de solution HEPES pH 8,4 de 10 mM.
6. Préparation des micropipettes
- Préparez des pipettes à partir de tubes capillaires en verre (1 mm de diamètre intérieur, 1,5 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur d’électrode horizontal. Ajustez les paramètres de sorte que l’extrémité extérieure de la micropipette tirée soit de ~ 2 à 5 μm. Avant de tirer, assurez-vous que les tubes de verre sont propres.
- Fixez les pipettes aux lames de verre pour les ranger et assurez-vous que la pointe n’entre pas en contact avec la surface de la lame car la pointe est fragile. Conserver à température ambiante dans un récipient couvert à l’abri de la poussière. Utilisez les pipettes le jour même où elles sont tirées.
7. Adhérence des billes PDL aux neurones
- Ajouter 40 à 60 μL de billes enrobées de PDL préparées à l’étape 5 à une culture cellulaire préparée à l’étape 4. Centrez la pointe de la pipette sur les neurones, qui sont faiblement visibles sur la lamelle, et ajoutez les billes (voir figure 4).
- Retournez l’échantillon dans l’incubateur pendant 1 h pour favoriser la formation de contacts synaptiques.
- Après l’incubation, retirez toutes les billes non collées en lavant délicatement la culture avec du NBM préchauffé.
8. Préparation d’une solution saline physiologique (pour les expériences à température ambiante)
- Préparez une solution saline physiologique. Il s’agit de réguler l’environnement cellulaire à l’extérieur de l’incubateur.
- Vérifiez l’osmolarité et les niveaux de pH.
- Perfusez continuellement la solution avec de l’O2 pour minimiser les fluctuations de pH pendant la réalisation des expériences.
- Chauffer à température ambiante.
- Installez le système de perfusion en insérant une extrémité d’un tube en plastique (dimensions facultatives) dans une solution physiologique infusée d’O2 et en fixant l’autre extrémité à une aiguille insérée dans le porte-échantillon. Placez le tube et la solution plus haut que l’échantillon (voir Figure 5).
- Débranchez le tube de l’aiguille et connectez-le à une seringue. Utilisez la seringue pour exercer une pression et aspirer le liquide, en remplissant le tube. Scellez à l’aide d’une pince à rouleau et reconnectez l’aiguille.
9. Micromanipulation des billes
- Installer l’échantillon dans un dispositif expérimental de telle sorte que les cellules puissent être accessibles par le haut par deux micropipettes montées dans des micromanipulateurs et accessibles optiquement en dessous, par exemple avec l’objectif de phase 40X (ouverture numérique de 0,6) d’un microscope optique inversé. Dans cette configuration, montez une caméra CCD pour la capture d’images sur le port latéral du microscope. Connectez chaque pipette à des seringues de 1 ml à l’aide d’un tube en plastique. À cette étape, remplacer la NBM par une solution saline physiologique (1 à 2 mL) (voir la figure 5).
- Au cours des expériences, perfuser en continu des cellules avec la solution saline physiologique préparée à l’étape 8 à un débit de 0,5 à 1 mL/min.
- Sélectionnez une perle PDL NON attachée à un neurone dans le champ de vision. Alignez la perle à l’aide d’une pointe de micropipette en vous concentrant sur la perle, puis jusqu’à la micropipette. Abaissez la pointe le plus près possible de la perle en la surveillant au microscope.
- Appliquez une pression négative avec la seringue de 1 mL reliée à la pipette pour prélever la bille. Maintenez une pression négative tout au long de l’expérience.
10. Tirer les neurites
- Sélectionnez une bille PDL attachée à un neurone dans le champ de vision et fixez-la à la deuxième micropipette à l’aide de l’aspiration comme décrit aux étapes 9.3-9.4.
- Tirez lentement sur le complexe PDL-bille-neurone (~0,5 μm/min), en déplaçant soit le micromanipulateur, soit l’étage d’échantillon de 1 μm et en faisant une pause de 5 min pour permettre l’initiation des neurites.
- Répétez l’étape 10.2 deux fois.
Remarque : Les premiers 3 μm doivent être tirés très lentement pour garantir le succès de l’expérience, ce qui se produit plus de 95 % du temps.
- Tirez le complexe PDL-bille-neurone en déplaçant lentement (~0,5 μm/min) le micromanipulateur ou l’étage d’échantillon de 2 μm et faites une pause de 5 min pour permettre l’élongation des neurites.
- Après une initiation réussie et une extension du neurite pendant les premiers 5 μm, tirez le neurite à 20 μm/min sur des distances millimétriques.
Remarque : La traction peut être effectuée en continu ou par étapes et à des vitesses variables. Voir la figure 6b-6c.
11. Connexion des neurones
- Sélectionnez une région riche en neurites et abaissez le complexe PDL-bille-neurite afin qu’il entre en contact physiquement avec elle. Utilisez d’autres billes pour évaluer la hauteur de la pointe au-dessus de la surface de la lamelle. Voir la figure 6d.
- Laissez le complexe PDL-bille-neurite en contact avec le neurite cible pendant que vous manipulez la deuxième micropipette. Abaissez la deuxième pipette avec la deuxième perle PDL sur le neurite nouvellement formé à environ 20 μm de la première bille. Utilisez la deuxième bille PDL pour pousser le nouveau filament de neurite vers la cellule cible.
- Maintenez les deux billes en place pendant au moins 1 h. Vérifiez l’absence de gonflement focal, un épaississement des neurites en contact avec la bille, avec le microscope16.
- Pendant ce temps, utilisez la perfusion pour changer lentement le milieu de l’échantillon d’une solution saline physiologique à un NBM préchauffé et équilibré en CO2.
- Libérez la perle de la deuxième pipette en relâchant l’aspiration. Si la nouvelle neurite reste attachée, libérez également la première bille. Voir la figure 6e .
- Retirer délicatement la solution saline et la remplacer par du NBM (~2 mL).
- Replacez soigneusement l’échantillon dans l’incubateur afin de renforcer la connexion neuronale pour les expériences futures. Cette connexion est stable pour >24
