Génération de neurones en reprogrammant des cellules de fibroblastes dermiques humains

Résumé

Source : Shrigley, S., et al. Génération simple d’une culture à haut rendement de neurones induits à partir de fibroblastes de peau humaine adulte. J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo démontre la génération de neurones à partir de fibroblastes dermiques humains adultes (aHDF). Les aHDF sont reprogrammés à l’aide d’un vecteur lentiviral portant des gènes pour les facteurs de transcription neuronales et les ARN en épingle à cheveux courts (shRNA). Les shRNA inhibent l’expression d’un répresseur transcriptionnel neuronal, et les facteurs de transcription neuronales activent les gènes pour différencier les aHDF en neurones. Ces aHDF reprogrammés sont cultivés dans un milieu de conversion neuronale précoce et tardive pour générer des neurones matures.

Protocole

1. Préparation des fibroblastes cutanés pour la reprogrammation

1. À l’aide d’un système automatisé de décongélation cellulaire ou d’un bain-marie à 37 °C, décongeler les fibroblastes dermiques humains adultes (FDHa) et en déposer 200 000 par fiole T75 (compter avec un compteur de cellules automatisé) dans 10 mL de milieu de fibroblastes (voir le tableau 1) à 37 °C dans 5 % de CO₂.
2. Effectuez un changement complet de milieu avec un milieu fibroblastique le lendemain.
3. Changez le milieu de fibroblaste tous les 3 à 4 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 95 % de confluence.
   note: Un flacon confluent contiendra environ 1 000 000 de cellules.

2. Placage pour la reprogrammation (Jour −1)

REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un revêtement de gélatine pour les expériences à court terme (jusqu’à 30 jours) ; alternativement, pour les expériences à long terme, il est recommandé de commencer par un revêtement de poly-L-ornithine, de fibronectine et de laminine (PFL).

1. 60 min avant de plaquer les aHDF pour la reprogrammation, enduire une plaque de 24 puits de gélatine à 0,1 % (250 μL/puits) et incuber à 37 °C.
2. Aspirez le milieu fibroblastique sur les aHDF. Laver une fois avec la solution saline tampon phosphate de Dulbecco (DPBS). Dissocier les cellules avec de la trypsine à 0,05 % (1,5 mL par fiole T75) à 37 °C pendant 3 à 5 min.
3. Ajouter un milieu fibroblastique pour neutraliser la trypsine (3 mL par rinçage par fiole T75) et recueillir les cellules détachées dans un tube de 15 mL en rinçant deux fois les cellules du ballon.
4. Faites tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu fibroblastique.
5. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (pour assurer une conversion de bonne qualité, vérifiez que la viabilité cellulaire est supérieure à 90 % avec une coloration au bleu de trypan).
6. Pour une plaque complète à 24 puits, préparez une suspension de 1 320 000 cellules dans 13,2 mL de milieu fibroblastique pour obtenir une suspension de 100 000 cellules/mL de milieu (ou 55 000 cellules/puits dans 550 μL de milieu fibroblastique multiplié par le nombre de puits nécessaires).
7. Aspirez la gélatine de la plaque et lavez-la deux fois avec du DPBS. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits et incuber toute la nuit à 37 °C dans 5 % de CO₂.

3. Transduction virale (Jour 0)

REMARQUE : Travailler avec des particules lentivirales nécessite un équipement de catégorie 2 et l’utilisation d’un agent pour neutraliser le virus. Le port de paires de gants doubles est également fortement recommandé.

1. Réchauffer 13,2 mL de fibroblaste à 37 °C.
2. Décongeler un vecteur lentiviral contenant les facteurs de transcription achaète-scute bHLH facteur de transcription 1 (Ascl1) et Brn2 avec deux ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) ciblant le facteur de transcription de silençage RE1 (REST) à température ambiante.
3. Ajouter le volume de lentivirus nécessaire pour infecter les HDFa à une multiplicité d’infection (MOI) de 20 dans le milieu sans aucun activateur de transduction.
   4. Maintenance des cellules en conversion

   REMARQUE : Une fois la conversion commencée, les cellules sont susceptibles de se soulever ; veillez à incliner la plaque vers le haut et utilisez une pipette de 1 000 μL lors du retrait du support pour éviter que les cellules ne se détachent.

   1. Le jour 3, retirer le milieu de fibroblaste et ajouter 500 μL de milieu de conversion neuronale précoce (voir tableau 1).
   2. Deux à trois fois par semaine, retirez 225 μL de milieu ancien du puits et ajoutez 250 μL de milieu de conversion neuronale précoce frais.
   3. Le 18e jour, retirer tout le milieu de chaque puits et le remplacer par 500 μL de milieu de conversion neuronale tardive (voir tableau 1).
   4. Continuez à changer la moitié du milieu comme ci-dessus avec un milieu de conversion neuronale tardive tous les 2 à 3 jours jusqu’au 25e jour ou au point final de l’expérience (Figure 1A).

   Tableau 1. Composition des différents milieux utilisés. Description complète de la composition des milieux nécessaires à ce protocole, y compris le milieu fibroblastique, le milieu de conversion neuronale précoce, le milieu de conversion neuronale tardive.

   	Concentration des actions	Concentration de travail
   Milieu fibroblastique
   Milieu basal	n/a	n/a
   Pénicilline/streptomycine	10 000 U/mL	100 mg/mL
   FBS	n/a	10 %
   Milieu de conversion neuronale précoce (ENM)
   Milieu de différenciation neuronale	n/a	n/a
   Pénicilline/streptomycine	10 000 U/mL	100 mg/mL
   CHIR99021	10 millions d’euros	2 μM
   Réf. SB-431542	20 millions d’euros	10 μM
   Caboche	100 μg/mL	0,5 μg/mL
   LDN-1931189	10 millions d’euros	0,5 μM
   APV	1 M	1 million d’euros
   LM-22A4	20 millions d’euros	2 μM
   GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
   NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
   db-cAMP	50 millions d’euros	0,5 million d’euros
   Milieu de conversion neuronale tardive (LNM)
   Milieu de différenciation neuronale	n/a	n/a
   Pénicilline/streptomycine	10 000 U/mL	100 mg/mL
   LM-22A4	20 millions d’euros	2 μM
   GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
   NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
   db-cAMP	50 millions d’euros	0,5 million d’euros

Résultats

Figure 1 : Évolution de la conversion iN au cours du temps.(A) Chronologie de l’expérience et carte de la construction emballée dans un lentivirus utilisé pour reprogrammer les fibroblastes dermiques humains adultes. Chaque flèche noire représente un changement moyen. (B) Images représentatives en contraste de phase illustrant les changements de morphologie de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignées cellulaires
Fibroblastes dermiques humains adultes			[C2 passage #7] Le donneur était une femme de 67 ans. Cellules obtenues des cliniques de recherche sur la maladie de Parkinson et de la maladie de Huntington au John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, Royaume-Uni).
Réactifs pour la culture, la transduction et la conversion de fibroblastes
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
Trypsine-EDTA [0,5 %]	Gibco	Référence 15400-054	Diluer à 0,05 % en DPBS.
Virkon (agent utilisé pour neutraliser le virus)	Viroderm	Référence 7511	Diluer à 1 % de solution avec de l’eau tiède.
Eau Milli-Q	Millipore
Milieu basal - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax	Gibco	61965059
Pénicilline/streptomycine [10 000 U/mL]	Gibco	Référence 15140-122
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	Référence 10270-106
CryoMACS® diméthylsulfoxyde (DMSO) 10	Miltenyi	Tél. : 170-076-303
Milieu de différenciation neuronale - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
LM-22A4	Tocris	Réf. 4607	Diluer 10 mg dans 1450 μL de DMSO. Concentration de la crosse : 20 mM.
Facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) [humain recombinant]	Systèmes de R&D	Référence 212-GD-010	Diluer 10 μg dans 500 μL 0,1 % BSA dans DPBS. Concentration de la matière : 20 μg/mL.
NT3 [humain recombinant]	Systèmes de R&D	Référence 267-N3-025	Diluer 25 μg dans 2,5 mL 0,1 % BSA dans DPBS. Concentration de la matière : 10 μg/mL.
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	Diluer 1 g dans 40,7 mL d’eau Milli-Q. Filtrer et faire des aliquotes de 500 μL ou des tubes mères de 10 mL. Concentration de la crosse : 50 mM.
CHIR99021	axone	1386	Diluer 2 μg dans 429,8 μL de DMSO. Concentration de la crosse : 10 mM.
LDN-193189	axone	1509	Diluer 2 mg dans 360 μL de DMSO. Concentration de la crosse : 10 mM.
Sel de sodium de l’acide valproïque (VPA)	Merck Millipore	Référence 676380	Diluer 5 g dans de l’eau Milli-Q pour obtenir une concentration de stock de 1 M. ATTENTION : Évitez l’ingestion, le contact avec la peau et la formation de poussière.
Réactifs pour revêtements
gélatine	Sigma Aldrich	G2500	Diluer à 0,1 % dans de l’eau Milli-Q.
Poly-L-ornithine	Sigma Aldrich	Réf. P3655	Dissoudre dans de l’eau Milli-Q. Utilisation à 15μg/mL.
Fibronectine	ThermoFisher Scientific	Référence 33010-018	2 mL d’eau Milli-Q + 70 μL 0,25 M NaOH. Utiliser à 5 μg/mL.
Laminine	ThermoFisher Scientific	Référence 23017-015	Conserver à -80 °C. Décongeler sur de la glace, conserver au frais et aliquote 30 μL. Utiliser à 5 μg/mL. Utiliser à 5 μg/mL.
équipement
Fiole T75 [Nunclon Delta Surface]	ThermoFisher Scientific	156499
Plaque à 24 puits [Nunc]	ThermoFisher Scientific	142485
Tube en polypropylène de 1,5 mL	Sigma Aldrich	Z336769
Tube faucon de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Tube faucon de 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
Manette Pippette			Pour des volumes de pipetage de 1 à 25 ml.
Pipettes sérologiques stériles : 5, 10 et 25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Pipettes à volume réglable : 5, 20, 200 et 1 000 μL
Pointes de pipette stériles			Pour des volumes de pipetage de 0,5 à 1 000 μL.
Système automatisé de décongélation cellulaire ThawSTAR	BioCision	BCS-601
Compteur de cellules automatisé Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Chambres de comptage cellulaire [50 lames] et bleu trypan [0,4 %]	ThermoFisher Scientific	Réf. C10228	À utiliser avec le compteur de cellules automatisé Countess II.
Hotte à flux laminaire
Incubateur humidifié 5 % CO2 37 °C
centrifugeuse			Convient aux tubes de 1,5, 15 et 50 ml.
Agitateur orbital
Microscope à fluorescence inversée	Leica	DMI6000 B