Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du pré-tranchage
- Préparez les milieux de « traitement des tissus » et les milieux de « maintenance de la culture de coupes » la veille de la résection de la tumeur et du prélèvement de tissus prévus (ou utilisez les milieux précédemment générés dans les 2 semaines). Ajouter 5 mL de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) et 5 mL d'acide 1 M 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanasinéulfonique (HEPES) à 500 mL d'un milieu Eagle modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose (DMEM) pour générer le milieu de traitement des tissus.
- Préparez 250 ml de milieu d’entretien de culture en tranches à l’aide d’une base de milieu neuronal (p. ex. Neurobasal) sans rouge de phénol. Complétez ce milieu avec 10 mM d’HEPES, 1x supplément de B-27, 400 μM de L-glutamine, 600 μM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 60 U/mL de pénicilline, 60 μg/mL de streptomycine et 6 U/mL de nystatine.
- Conservez tous les supports à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
2. Jour de l’opération : Acquisition de tissus
- Le jour de l’acquisition des tissus, préparer 50 à 100 mL de solutions à 1 % et à 2 % (en poids/vol) d’agarose à basse température de fusion dans des milieux de traitement des tissus à l’aide d’une verrerie autoclavée et d’une technique stérile dans une hotte à flux laminaire. Les deux concentrations d’agarose sont nécessaires pour s’adapter aux variations imprévisibles de la consistance du tissu tumoral.
- Chauffer la suspension d’agarose, à l’aide d’un micro-ondes, jusqu’à ce qu’une légère ébullition soit observée. Placez la solution d’agarose dans un bain-marie à 37 °C pour la maintenir à l’état liquide jusqu’à l’utilisation.
- Placer 1 mL de milieu d’entretien de la culture en tranches dans chaque puits d’une plaque à 6 puits.
- À l’aide d’une pince stérile, placez des inserts de culture vides en polytétrafluoroéthylène (PTFE) dans chaque puits. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire humidifié, muni d’une chemise d’eau, avec une atmosphère de CO2 à 5 % maintenue à 37 °C.
- À l’aide d’une pipette Pasteur stérile dans une hotte à flux laminaire, faites bouillir un mélange de gaz à 95 % O2/5 % CO2 dans un flacon contenant du milieu de traitement des tissus glacés pendant environ 15 à 30 minutes, avant l’acquisition du tissu tumoral. L’utilisation de milieux supra-oxygénés minimise l’hypoxie dans les tissus en vrac pendant le traitement.
- Préparez des tubes coniques de 50 ml (suffisants pour isoler le nombre souhaité de régions tumorales individuelles) contenant 20 ml d’aliquotes de milieu de traitement supra-oxygéné et glacé pour transporter les tissus entre la salle d’opération et l’installation de tranchage.
- En collaboration avec un neurochirurgien, planifiez avant l’opération la région tumorale pour l’acquisition de l’échantillon. Sélectionner une région tumorale avec une augmentation du contraste comme démontré sur l'imagerie clinique du patient (séquences d'imagerie par résonance magnétique (IRM) post-gadolinium T1). L’expérience antérieure suggère que cette zone produit du tissu tumoral viable par opposition au tissu nécrotique.
note: La génération de tranches à partir de la substance blanche environnante (péritumorale) a été tentée ; Cependant, l’autofluorescence de fond et la diminution de la densité des cellules tumorales ont limité l’utilité expérimentale de ces tranches.
- Obtenez du tissu tumoral vers le début de la résection tumorale. Évitez de prélever du tissu tumoral exposé à une cautérisation bipolaire étendue, ce qui pourrait compromettre la viabilité des tissus à la suite d’une lésion thermique. Les échantillons de tissus obtenus lors de la résection tumorale fragmentaire présentent une viabilité accrue par rapport aux tissus acquis lors de résections en bloc prolongées. Cette observation peut être liée à une privation différentielle de tissu tumoral du flux sanguin à la suite d’une résection chirurgicale et d’un délai prolongé d’acquisition.
- Si vous le souhaitez, étiquetez et stockez le tissu tumoral dans des tubes coniques séparés pour isoler les échantillons de régions tumorales distinctes. (c’est-à-dire tissu tumoral superficiel ou profond). Des localisations précises des tissus peuvent être enregistrées si/quand la navigation chirurgicale peropératoire est disponible.
3. Préparation de la culture en tranches
- Placez des morceaux de tissu tumoral dans une boîte de Pétri avec un milieu de traitement glacé. Pour laver le tissu tumoral et minimiser les globules rouges adhérents, utilisez une pipette pour échanger doucement et jeter trois fois le milieu dans la boîte de Pétri.
- À l’aide d’un scalpel, coupez des morceaux de tumeur en forme de boîte rectangulaire. Coupez les morceaux de tissu à environ 3 mm x 3 mm x 10 mm. Retirez avec précaution tous les vaisseaux attachés par excision ou par traction douce avec des pinces fines.
- Pipeter 5 à 7 mL d’agarose à 37 °C dans un petit moule d’enrobage en plastique en forme de cube (~ 2 cm3). Confirmer que la température de la solution d’agarose ne dépasse pas 37 °C à l’aide d’un thermomètre stérile avant utilisation.
- Laissez l’agarose reposer pendant environ 1 minute sur un lit de glace.
- Placez 2 à 4 « bandes » de tissu tumoral dans de l’agarose avec un grand axe orienté verticalement. note: Les bandes de tissu auront tendance à « s’enfoncer » dans l’agarose avant la solidification. Pour éviter cette complication, maintenez temporairement la bande de tissu en orientation verticale jusqu’à ce que l’agarose soit davantage solidifiée.
- Conservez le tissu contenant de la moisissure d’agarose sur un lit de glace pendant 2 à 5 minutes pour faciliter la solidification.
- Retirez la moisissure de la glace et retirez délicatement le bloc d’agarose en coupant les côtés de la forme avec un scalpel. Évitez d’exercer une force excessive sur le bloc, ce qui pourrait fracturer l’agarose.
- Utilisez une généreuse goutte de colle cyanoacrylate pour fixer le bloc d’agarose sur la plaque d’échantillon du vibratome. Laissez la colle prendre pendant environ 1 à 2 min.
- Remplissez le réservoir du vibratome avec un média de traitement glacé pour immerger le bloc d’agarose fixé à la plaque d’échantillon.
- Pendant le tranchage, faites buller le mélange gazeux 95 % O2 / 5 % CO2 dans le réservoir du vibratome à l’aide d’une pipette en plastique stérile taillée.
- Réglez l’épaisseur de la tranche du vibratome sur 300 - 350 μm.
- Ajustez la vitesse d’avancement de la lame et l’amplitude de la lame en fonction de la consistance du tissu. Le tissu glioblastome « plus rigide » nécessite des vitesses d’avance de la lame plus lentes et une amplitude plus élevée. Les réglages exacts de la vitesse et de l’amplitude de la lame varient en fonction des spécifications du vibratome.
note: Plusieurs problèmes surviennent souvent lors du tranchage. Si la bande tissulaire se détache du bloc d’agarose, essayez d’intégrer le tissu dans une agare à plus forte concentration. Si les tranches tumorales sont plus épaisses que souhaitées (réglage de la machine), ou sont asymétriques, augmentez l’amplitude et diminuez la vitesse de la lame du vibratome. Pour vous assurer que le tissu tumoral n’est pas collé ou « traîné » par le porte-lame, au moment du tranchage, positionnez soigneusement la microspatule entre le porte-lame et la tranche, pendant que la lame se déplace.
- Transférez les tranches de tissu dans une boîte de Pétri à l’aide d’un support de traitement glacé à l’aide d’une microspatule en acier inoxydable.
- Procurez-vous des plaques à 6 puits contenant des inserts en PTFE et des milieux de culture en tranches équilibrées de l’incubateur (comme préparé à la section 2, étape 4).
- Dressez les tranches de tissu à l’aide d’une microspatule en acier inoxydable. Minimisez le contact direct et la manipulation des tissus en utilisant un petit pinceau à poils fins pour générer une « onde fluide » afin de pousser doucement la tranche de la spatule sur l’insert de culture.
note: Minimisez la quantité de milieu de traitement introduite sur le dessus de l’insert de culture tissulaire. Si des quantités excessives de milieu sont transférées et que les tranches flottent, utilisez une pipette Pasteur stérile pour retirer le milieu.
- Retournez les plaques à 6 puits contenant les tranches de tumeur dans un incubateur maintenu à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2.
note: L’ensemble du protocole d’enrobage et de tranchage doit être terminé dans les 90 minutes suivant l’acquisition du tissu tumoral depuis la salle d’opération.
4. Maintenance de la culture en tranches
- Après 12 à 24 h, transférez les cultures de tranches en saisissant chaque bord d’insert avec une pince stérile, puis transférez-les sur des plaques contenant des milieux d’entretien de culture de tranches fraîches. S’assurer que le milieu de culture en tranches aliquotes dans chaque puits s’équilibre dans l’incubateur pendant au moins 15 minutes avant de transférer les inserts.
- Déplacer les inserts vers de nouvelles plaques à 6 puits avec des milieux de culture en tranches fraîches et équilibrées toutes les 48 h.
- Si vous le souhaitez, aliquote un vieux milieu de culture en tranches à l’aide d’une pipette pour une utilisation immédiate dans des essais biochimiques ou congeler à -80 °C pour une utilisation future.
