Développement d’un modèle de culture cellulaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine

Résumé

Source : Fattakhov, N., et al. Un modèle de culture cellulaire primaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine pour l’étude in vitro de l’AVC ischémique. J. Vis. Exp.(2022)

Cette vidéo démontre la co-culture du péricyte, de l’astrocyte et des cellules endothéliales du cerveau humain. Chaque couche cellulaire est formée séparément puis cultivée ensemble, créant un système à trois couches qui imite l’arrangement cellulaire de la barrière hémato-encéphalique

Protocole

1. Réglage du modèle BBB de culture cellulaire triple

1. Péricytes d’ensemencement
   1. Cultiver des péricytes vasculaires du cerveau humain (HBVP) dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient confluents. Une fois la confluence atteinte, aspirez l'ancien milieu péricytaire et lavez les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) chaude. Aspirer le DPBS et détacher les cellules du ballon à l’aide d’une combinaison de 4 mL de solution chaude de trypsine-EDTA et de 1 mL de DPBS.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P7.
   2. Incuber le ballon pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur de CO₂. Observez au microscope pour confirmer si les cellules sont détachées du flacon. Ajouter 5 mL de milieu péricytaire chaud (contenant 2 % de sérum de veau fœtal) dans la fiole et transférer les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 50 mL.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 200 × g, en laissant les cellules former une pastille au fond du tube. Aspirez le fluide du tube, en veillant à ce que la pastille de cellule reste intacte.
   4. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu péricytaire ; calculer la quantité de milieu en fonction de la confluence des cellules et du nombre d’inserts nécessaires. Prenez 10 μL de cellules remises en suspension, placez-les dans une lame de comptage de cellules et comptez le nombre de cellules.
   5. Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules/insert dans 1 mL de milieu péricytaire sur le côté abluminal des inserts de puits (format 6 puits).
      note: Lors de l’ensemencement de HBVP sur la face inférieure des inserts, il est important de retourner les plaques de puits d’insertion. Pendant que la plaque est posée à plat sur une surface, retirez la section inférieure pour exposer le côté abluminal des inserts de puits. Couvrez les inserts du puits avec la plaque retournée après avoir ajouté une suspension de cellules péricytaires sur le côté abluminal pour éviter l’évaporation. Conservez toutes les assiettes retournées dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
2. Ensemencement des astrocytes
   1. Cultiver de l’AH (astrocytes humains) dans des flacons T75 à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant du milieu astrocytaire (contenant également 2 % de FBS) au lieu du milieu péricytaire.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P9.
   2. Déterminez la densité cellulaire et ensemencez 300 000 cellules/puits au fond des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Couvrez la plaque pour éviter l’évaporation et conservez toutes les plaques dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
3. Ensemencement de cellules endothéliales
   1. Cultivez des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) dans des boîtes de culture tissulaire à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient confluentes. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu classique complet (contenant 10 % de FBS) au lieu d’un milieu péricytaire.
      note: Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P12.
   2. Sortez les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant des astrocytes et les inserts à puits (format à 6 puits) contenant des péricytes de l’incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C. Aspirez le milieu astrocytaire des plaques à 6 puits de culture tissulaire. Ajouter 1 mL de milieu péricytaire et 1 mL de milieu astrocytaire dans chaque puits.
   3. Aspirez le milieu péricytaire des inserts de puits et placez-le dans les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes ensemencés. Semez HBMEC à une densité de 300 000 cellules/puits dans 2 mL du milieu classique complet sur la face apicale des mêmes inserts de puits.
      note: Les cellules endothéliales doivent être ensemencées sur le côté apical des puits le lendemain après l’ensemencement des péricytes du côté abluminal des puits et des astrocytes sur des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les cellules doivent être maintenues en culture triple pendant six jours pour induire des propriétés similaires à celles de la BHE. Le milieu de culture cellulaire doit être changé dans les deux compartiments bien insérés 24 heures avant les expériences.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Transwell de 24 mm avec insert de membrane en polyester poreux de 0,4 μm	Corning	N° 3450
Plats à fond en verre de 35 mm	MatTek Sciences de la Vie (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Cellule scientifique	1801
Facteur d’attachement	Systèmes cellulaires (Fisher Scientific)	Réf. 4Z0-201
Milieu classique complet avec sérum et CultureBoost	4Z0-500	Systèmes cellulaires
Tubes à centrifuger en PP Corning de 50 ml (fond conique avec capuchon CentriStar)	VWR	430829
Corning 75cm² Col incliné en forme de U non traité Flacon de culture cellulaire	Corning	Réf. 431464U
Corning CellBIND 96 puits plat à fond transparent Microplaques de polystyrène noir	Corning	Référence 3340
Lames de chambre de comptage cellulaire Countes	Thermo Fisher Scientific	Réf. C10228
Compteur de cellules automatisé Countess II FL	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Milieu DMEM (sans glucose, sans glutamine, sans rouge de phénol)	ThermoFisher	Référence A14430-01	Milieu sans glucose
DPBS (sans calcium, sans magnésium)	ThermoFisher	14190250
Milieu basal de croissance des cellules endothéliales EBM, sans rouge de phénol, 500 mL	Lonza	CC-3129
Incubateur à CO2
centrifugeuse