Procédé de bio-impression 3D d’astrocytes corticaux murins

1. Synthèse de la gélatine méthacryloyle (GelMA)

1. Peser 10 g de gélatine obtenue à partir de peau de porc et dissoudre dans 100 mL de PBS en laissant la solution remuer sur une plaque chauffante à 240 tr/min et 50 °C jusqu’à dissolution complète.
2. Sous une hotte, ajouter 2 mL d’anhydride méthacrylique (MA) pour un faible degré de fonctionnalisation, et laisser l’émulsion de gélatine remuer à 240 tr/min et 50 °C pendant 2 h.
   prudence: Mention de danger MA : H302 + H332 (nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation), H311 (toxique au contact de la peau), 314 (provoque de graves brûlures cutanées et lésions oculaires), 315 (provoque une irritation cutanée), H317 (peut provoquer une réaction allergique cutanée), H318 (provoque des lésions oculaires graves), 331 (toxique en cas d’inhalation), H332 (nocif en cas d’inhalation), H335 (peut provoquer une irritation respiratoire). Instructions de manipulation : P261 (éviter de respirer la poussière/les fumées/les gaz/les brouillards/les vapeurs/les aérosols), P305 + P351 + P338 + P310 (EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes. Retirez les lentilles de contact, si elles sont présentes et faciles à faire. Continuez à rincer. Appelez immédiatement un CENTRE ANTIPOISON/médecin), P301 + P312 + P330 (EN CAS D’INGESTION : Appelez un CENTRE antipoison/médecin si vous ne vous sentez pas bien. Rincer la bouche).
   note: Ajoutez MA très lentement, goutte à goutte.
3. Diluer la solution de gélatine-MA dans 100 mL de PBS préchauffé (50 °C) pour obtenir 200 mL de volume final et laisser la solution remuer à 240 tr/min et 50 °C pendant 10 min.
4. Coupez ~20 cm de membrane de dialyse (coupure moléculaire 12-14 kDa) et trempez-la dans de l’eau désionisée jusqu’à ce qu’elle soit molle.
   note: Remplissez les membranes avec de l’eau déminéralisée pour éviter les trous ou les défauts.
5. À l’aide d’un entonnoir, transférez la solution de gélatine-MA dans les membranes.
   note: Fermez les deux côtés en laissant un espace supplémentaire à l’intérieur pour permettre le mélange.
6. Placez les membranes contenant la solution de gélatine-MA dans un récipient contenant 2 L d’eau distillée pour la dialyse et laissez-les agiter à 40 °C pendant 5 jours (500 tr/min).
   note: Couvrez le récipient pour éviter l’évaporation de l’eau.
7. Changez l’eau distillée deux fois par jour. À chaque fois, retournez les membranes pour l’homogénéisation.
8. Le cinquième jour, mélanger 200 ml d’eau ultrapure préchauffée (40 °C) avec la gélatine-MA dialysée et agiter pendant 15 minutes à 40 °C.
9. Transvaser la solution de gélatine-MA dans des tubes coniques de 50 mL jusqu’à 25 mL et laisser les tubes à -80 °C pendant 2 jours.
   note: Stockez les tubes à l’horizontale pour faciliter la lyophilisation.
10. Lyophiliser les solutions congelées pendant 3 à 5 jours et conserver le GelMA lyophilisé à l’abri de l’humidité.

2. Préparation de la bio-encre

REMARQUE : Afin d’obtenir 1 mL de bio-encre, il est recommandé de fabriquer au moins 3 mL de solution de biomatériau, car il peut y avoir des pertes pendant la filtration.

1. Préparation de la solution de fibrinogène
   1. Préparer une solution saline (NaCl 0,9 %) dans de l’eau désionisée et dissoudre 10 mg de fibrinogène de plasma bovin dans 1 mL de solution saline pour obtenir une concentration de 10 mg/mL.
      note: Comme le fibrinogène s’adsorbe sur le verre, n’utilisez pas de flacons en verre pour préparer la solution de fibrinogène.
   2. Laisser la solution agitée à 37 °C jusqu’à dissolution complète du fibrinogène.
      REMARQUE : Pour la dissolution du fibrinogène, utilisez un système rotatif placé à l’intérieur d’un four à 37 °C. L’agitation magnétique (180 tr/min) du fibrinogène sur une plaque chauffante à 37 °C convient également. Dans ces conditions, il faut environ 40 minutes pour dissoudre du fibrinogène à 10 mg/mL.
2. Préparation de la solution de gélatine/GelMA
   1. Peser 0,12 g de gélatine et l’ajouter à 1,9 mL de PBS préchauffé (40 °C) pour obtenir une concentration finale de 4 % (p/v) de gélatine. Vortex pour faciliter la dissolution.
   2. Maintenir l’émulsion à 40 °C jusqu’à dissolution complète.
   3. Peser 0,06 g de GelMA lyophilisé et le transférer dans la solution de gélatine pour obtenir une concentration finale de 2 % (p/v) de GelMA. Vortex pour faciliter la dissolution.
   4. Maintenir la solution à 40 °C jusqu’à dissolution complète.

3. Préparation de la gélatine chargée d’astrocytes/GelMA/bio-encre de fibrinogène

1. Pipeter 0,9 mL de la solution de fibrinogène à 10 mg/mL et transférer dans la solution de gélatine/GelMA pour obtenir une concentration finale de 3 mg/mL de fibrinogène.
2. Peser 0,015 g de photo-initiateur (PI) et transférer dans la solution de gélatine/GelMA/fibrinogène pour obtenir une concentration finale de 0,5 % (p/v) de PI. Mélangez la solution en retournant le tube de haut en bas et maintenez-le à 40 °C à l’abri de la lumière pour éviter la dégradation de l’IP.
   note: Stockez la bioencre à 4 °C pendant 24 h maximum.
3. Sous le flux laminaire, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm dans un tube conique stérile de 15 mL.
   note: La solution de biomatériau doit être à 37-40 °C pour permettre la filtration.
4. Transférez 980 μL de la solution de biomatériau dans un tube conique de 15 mL.
5. Diluer la laminine dans une solution saline pour obtenir une solution mère de 100 μg/mL.
6. Pipeter 20 μL de laminine et transférer dans le tube contenant la bio-encre pour obtenir une concentration finale de 2 μg/mL de laminine.
7. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas, en évitant les bulles. Si des bulles persistent, centrifugez le tube conique à 200 x g pendant 2 min. Maintenez la bio-encre à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit mélangée aux cellules.
8. Trypsiniser les astrocytes primaires avec 0,05 % de trypsine pendant 5 min.
   note: Utilisez les astrocytes des passages 1 à 3.
9. Neutralisez l’activité de la trypsine avec le FBS dans un rapport de 1:1 et transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifugez-le à 200 x g pendant 5 min.
10. Comptez les cellules et transférez 1 x 106 cellules dans un autre tube conique. Centrifugez-le à 200 x g pendant 5 min.
11. Retirez le surnageant en laissant un petit volume (~200 μL) pour suspendre la pastille cellulaire, en tapotant doucement le bas du tube conique.
12. Transvasez 1 mL de solution de gélatine/GelMA/fibrinogène dans le tube contenant les cellules et pipetez doucement de haut en bas pour homogénéiser, obtenant une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/mL.

3. Préparation de la solution de réticulation

1. Reconstitution de la thrombine
   1. Préparer une solution mère de thrombine à 100 U/mL dans de l’eau désionisée stérile contenant 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tube conique de 15 mL. Stock en microtubes à -20 °C.
      REMARQUE : Comme la thrombine s’adsorbe sur le verre, n’utilisez pas de flacons en verre pour préparer la solution mère ou stocker les aliquotes.
2. Préparation de la solution de thrombine-CaCl₂
   1. Pipeter 100 μL de solution mère de thrombine et transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 8,9 mL d’eau déminéralisée stérile pour obtenir une concentration finale de 1 U/mL de thrombine.
   2. Préparez une solution de CaCl₂ à 10 % (p/v) dans de l’eau désionisée et stérilisez à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
   3. Transférez 1,1 mL de la solution de CaCl₂ à 10 % dans le tube conique contenant de la thrombine afin d’obtenir un rapport final de 1:9 (CaCl₂ à la thrombine).
      note: Préparez la solution de réticulation au volume pour l’expérience, en évitant le stockage.

4. Bio-impression de bio-encre chargée d’astrocytes à l’aide d’une bio-imprimante basée sur l’extrusion

1. Conception du tissu neural
   1. À l’aide du code G : construisez une grille de 6 x 6 mm (forme carrée) avec une distance de 1 mm entre chaque ligne bio-imprimée sur les axes X et Y, et 6 couches sur l’axe Z (0,2 mm entre chaque ligne) ; réglez l’extrusion (E) sur 0,01 mm, en augmentant de 0,001 mm à chaque nouvelle couche de l’axe Z ; et réglez la vitesse d’impression (F) sur 400 mm/min (informations supplémentaires).
2. Configuration de la bio-imprimante
   1. Exposez la machine à la lumière UV pendant 15 min, puis essuyez-la avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Allumez la bio-imprimante à l’aide de l’interrupteur d’alimentation. Connectez la machine à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB. Ouvrez le logiciel de contrôle pour le connecter à la bio-imprimante et chargez le fichier de conception.
3. Préparation de la seringue de bio-impression
   1. Transférez la gélatine/GelMA/fibrinogène chargée d’astrocytes dans une seringue en plastique de 5 ml à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
      note: Transvasez lentement pour éviter la formation de bulles.
   2. Connectez une aiguille émoussée stérile de 22 G à la seringue.
      note: Laissez la seringue à 4 °C pendant 2 min.
   3. Connectez la seringue à la tête d’impression de la bio-imprimante et rincez manuellement la bioencre pour éliminer les bulles restantes.
4. Bio-impression
   REMARQUE : La bio-impression a été réalisée à l’extérieur du capot laminaire.
   1. Placez une boîte de culture de 35 mm sur la table de la bio-imprimante et positionnez l’aiguille à 0,1 mm de la surface de la boîte de culture pour permettre le mouvement de l’aiguille.
      REMARQUE : Utilisez une boîte de culture de 35 mm pour chaque bio-impression.
   2. Appuyez sur le bouton Imprimer.
   3. Une fois la bio-impression terminée, assurez-vous que la seringue s’éloigne de la parabole. Ensuite, fermez la coupelle de culture et préparez-vous pour le processus de réticulation.
      note: La bio-impression d’une construction prend environ 1 min et 10 s.
5. Lien entre la construction bio-imprimée et la culture
   1. Placez la boîte de culture sous une lumière UV à 2 mW/cm2 pendant 2 x 60 s (haut et bas) pour la réticulation GelMA.
   2. Sous le flux laminaire, transférez la construction bio-imprimée sur une plaque à 24 puits à l’aide d’une spatule stérile.
   3. Ajouter 500 μL de solution de thrombine/CaCl₂ et laisser agir 30 min pour permettre la réticulation de la fibrine.
   4. Retirez la solution de réticulation et lavez la construction avec 2 ml de PBS 1x. Ensuite, remplacer le PBS par 1 mL de milieu de culture d’astrocytes et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂. Changez de support tous les 3 jours.