Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Thiolation de l’acide hyaluronique
REMARQUE : Les rapports molaires sont indiqués par rapport à un nombre total de groupes carboxylates, sauf indication contraire.
- Dissoudre 500 mg d’hyaluronate de sodium (HA, 500-750 kDa) à 10 mg/mL dans de l’eau distillée désionisée (DiH2O) dans un erlenmeyer de 250 mL stérilisé en autoclave. Remuez la solution (~200 tr/min) à température ambiante pendant 2 heures pour dissoudre complètement l’HA. Utilisez une barre d’agitation et une plaque d’agitation magnétique pour maintenir l’agitation de réaction pendant la procédure de thiolation.
- À l’aide d’acide chlorhydrique (HCl) 0,1 M, ajustez le pH de la solution d’AH à 5,5. Peser 69,6 mg (0,25x le rapport molaire) de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
note: Bien que l’EDC non dissous puisse être ajouté directement à la solution d’AH, il est généralement plus facile de dissoudre d’abord l’EDC dans 1 mL de DiH2O, puis d’ajouter rapidement la solution d’EDC à la solution d’AH. La prédissolution dans 1 mL deDiH2O peut également être effectuée avec du N-hydroxysuccinimide (NHS) et du dihydrocholoride de cystamine avant d’être ajoutée à la réaction aux étapes 1.3 et 1.4.
- Ajoutez 17,9 mg (0,125x le rapport molaire) de NHS à la réaction. Ajustez le pH de la solution réactionnelle à 5,5 à l’aide de HCl 0,1 M et incubez la réaction à température ambiante pendant 45 minutes.
- Ajouter 70,0 mg (rapport molaire de 0,25) de dichlorhydrate de cystamine dans la solution réactionnelle. Utilisez de l’hydroxyde de sodium (NaOH) de 0,1 M pour ajuster le pH à 6,25. Incuber la réaction à température ambiante pendant la nuit en remuant.
- Le lendemain, utilisez 1 M de NaOH pour ajuster le pH de la solution réactionnelle à environ 8. Ajoutez 192 mg (rapport molaire 4x) de dithiothréitol (DTT) à la réaction. Ajustez le pH à 8 après l’ajout de DTT et laissez remuer pendant 1 à 2 heures à température ambiante.
- Utilisez 1 M HCl pour ajuster le pH à 4. Transvasez l’ensemble du mélange réactionnel dans une membrane de dialyse pré-trempée (poids moléculaire seuil d’environ 13 kDa) et dialysez contre DiH2O pré-ajusté à pH 4,
note: Le volume de DiH2O pour la dialyse doit être au moins 40 fois supérieur au volume de la solution d’AH ayant réagi (p. ex. 50 mL d’échantillon dans 2 L de DiH2O, pH 4).
- Remplacer la solution de dialyse (DiH2O, pH 4) deux fois par jour pendant 3 jours à température ambiante.
- Filtrez la solution dialysée à travers un filtre à membrane de 0,22 μm, entraîné par vide. Solution de congélation instantanée d’AH thiolé dans de l’azote liquide. Utilisez un lyophilisateur pour lyophiliser les échantillons pendant 2 jours. L’AH thiolé sous forme sèche peut être stocké dans un dessiccateur scellé sous vide à -20 °C pendant au moins 6 mois.
- Pour déterminer le degré de thiolation, utilisez le test d'Ellman et/ou la spectroscopie RMN des protons.
2. Préparation des matériaux de réticulation
- Dissoudre l'AH thiolé à la concentration souhaitée (dans cet exemple, 13,3 mg/mL) dans une solution saline tamponnée HEPES (20 mM HEPES dans un tampon salin au sel équilibré de Hank, ajusté pour se situer à un pH de 8-9) dans un flacon ambré pour minimiser l'exposition à la lumière ambiante. Gardez la solution en remuant constamment.
note: La formation de liaisons disulfure entre les thiols conjugués à l’AH peut se produire si le pH est supérieur à 8, si la concentration de la solution est trop élevée ou si la solution est laissée en agitation trop longtemps avant la gélification. Pour éviter ce problème, utilisez moins de 15 mg/mL d’AH thiolé et dissolvez l’AH thiolé dans les 2 heures suivant la formation des hydrogels.
- Dissoudre le PEG-maleimide à 4 bras (PEG-Mal, 20 kDa) et le PEG-thiol à 4 bras (PEG-thiol, 20 kDa) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, pour préparer des solutions mères de PEG-Mal et de PEG-thiol à 50 mg/mL.
note: Il faut au moins 1 heure pour dissoudre complètement les réactifs PEG.
- Si vous ajoutez des peptides dérivés de la MEC, dissoudre les peptides contenant de la cystéine dans le PBS pour préparer une solution mère.
note: Utilisez une concentration de stock de 2 à 4 mM.
- Faites tremper les moules en caoutchouc de silicone dans de l’éthanol pendant au moins 20 min pour les nettoyer, puis autoclavez-les pour les stériliser.
3. Réticulation de l’hydrogel et encapsulation cellulaire
REMARQUE : À titre d’exemple, l’encapsulation de quatre hydrogels individuels de 80 μL avec 0,5 % (p/v) d’HA et un module de compression de 1 kPa est décrite3. Veuillez consulter le tableau 1, par exemple, les recettes qui produisent des hydrogels aux propriétés variables : deux hydrogels incorporant le peptide de liaison à l’intégrine RGD et deux hydrogels incorporant des capuchons de cystéine comme contrôle négatif de l’activité peptidique. La concentration d’ensemencement des cellules GBM dérivées de patients est de 500 000 cellules/ml.
- Diluer la solution mère PEG-Mal (50 mg/mL, à partir de l’étape 2.2) à 12,5 mg/mL en ajoutant 40 μL de la solution mère à 120 μL de PBS. Divisez la solution diluée en deux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de 80 μL chacun.
- Ajouter 16 μL de solution mère de RGD (2,8 mM, à partir de l’étape 2.3) dans un tube et 16 μL de solution mère de cystéine (2,8 mM, à partir de l’étape 2.3) dans le deuxième tube. Vortex à mélanger. Placez les solutions PEG-Mal-RGD ou PEG-Mal-CYS sur de la glace jusqu’à l’étape 3.9.
note: La procédure décrite ici permet d’obtenir des hydrogels avec ~140 μM de peptide. Cela équivaut à environ 1 bras PEG sur 8 disponibles occupés par un peptide. Cela peut être varié en modifiant le rapport molaire des peptides terminés par la cystéine par rapport aux groupes de maléimides disponibles. En général, une concentration maximale de 280 μM de peptide peut être atteinte tout en laissant un nombre suffisant de groupes maléimides disponibles pour la réticulation de l’hydrogel.
- Diluer la solution mère de PEG-thiol (50 mg/mL, à partir de l’étape 2.2) à 5 mg/mL en mélangeant 4 μL de solution mère à 50 mg/mL avec 36 μL de PBS. Ajouter 120 μL d’AH thiolé dissous de l’étape 2.1 au mélange.
note: Les solutions de HMW HA sont très visqueuses. Ainsi, nous recommandons d’utiliser une pointe de micropipette à large orifice pour transférer les solutions. Pipetez lentement pour éviter que la solution ne colle aux parois de la pointe de la micropipette et pour améliorer la précision de la mesure.
- Placez les moules propres et secs (préparés à l’étape 2.4) dans chaque puits d’une plaque à 12 puits non traitée par culture tissulaire. À l’aide de l’extrémité propre et émoussée d’une pointe de pipette, appuyez sur le moule en gel et vérifiez l’étanchéité entre les moules et le fond de la plaque du puits.
note: Vérifiez à nouveau l’étanchéité juste avant l’encapsulation pour éviter les fuites.
- Passage des cellules GBM cultivées, dissociation en cellules uniques et détermination de la concentration cellulaire comme décrit précédemment3.
note: Certaines lignées de GBM ne peuvent pas être dissociées en cellules uniques. Dans ce cas, des gliomasphères entières peuvent être encapsulées. Cependant, préparez des cellules uniques dissociées après un comptage précis des cellules pour améliorer la reproductibilité. Le protocole de passage de la gliomasphère varie d’un laboratoire à l’autre, et beaucoup d’entre eux sont probablement compatibles avec l’encapsulation d’hydrogel.
- (Recommandé) Centrifugez les gliomasphères à 500 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d’enzyme de dissociation cellulaire à la pastille cellulaire. Ensuite, incubez pendant 5 min en tapotant doucement le tube pour agiter.
- Ajouter 4 mL de milieu de culture complet (50 ng/mL d’EGF, 20 ng/mL de FGF-2, 25 μg/mL d’héparine, supplément de G21 et 1 % de pénicilline/streptomycine dans du DMEM/F12) dans les cellules.
- Centrifuger à nouveau à 500 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Enfin, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL du milieu complet et faire passer les cellules en suspension dans une crépine cellulaire de 70 μm. (Recommandé) laver la passoire avec 4 ml supplémentaires du milieu complet pour maximiser le nombre de cellules récupérées.
- Estimez la concentration de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre. Divisez la suspension cellulaire en 2 tubes à centrifuger, où chaque tube contient ~80 000 cellules. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min ; généralement, 80 000 cellules constitueront 2 hydrogels de 80 μL.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension une pastille dans 80 μL de solution de PEG-MAL-RGD et une seconde pastille dans 80 μL de solution de PEG-MAL-CYS (préparée à l’étape 3.1).
- À l’aide d’une pointe de micropipette à large orifice de 200 μL, versez 40 μL de solution d’AH (de l’étape 3.3 ci-dessus) dans chaque moule en caoutchouc silicone (comme préparé à l’étape 3.4).
- À l’aide d’une pointe de micropipette à large orifice de 200 μL, mélangez les 40 μL de solution cellulaire PEG-MAL-CYS ou PEG-MAL-RGD avec la solution HA dans le moule. Pipette de haut en bas rapidement, pas plus de 10 fois. Répétez l’opération pour chaque culture de gel en cours de préparation.
note: Cette étape demande de la pratique, car la gélification initiale se produit rapidement (en 30 s). Pipetez de haut en bas tout en déplaçant la pointe à différents endroits dans les moules pour assurer un mélange uniforme. Gardez toujours l’embout en dessous du niveau du liquide pour éviter la formation de bulles d’air. Ne mélangez pas la solution trop souvent car du gel pourrait se former à l’intérieur de l’embout de la micropipette. PEG-MAL-CYS et PEG-MAL-RGD peuvent être combinés à des ratios variables pour obtenir la concentration souhaitée de peptides RGD.
- Placez la plaque contenant les cellules encapsulées dans du gel dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 5 à 10 minutes pour assurer la fin de la réaction.
- Ajouter 2 à 2,5 ml de milieu de culture dans chaque puits avec les gels formés. À l’aide d’une pointe de pipette stérile de 2 μL ou d’une micro-spatule pour séparer délicatement le moule et le gel. Utilisez une pince pré-stérilisée pour retirer le moule de la plaque du puits. Replacez la plaque du puits dans l’incubateur cellulaire (37 °C et 5 % CO2) pour la culture et les expériences futures.
note: Tirez le moule verticalement vers le haut pour éviter d’endommager les cultures de gel. En général, le milieu dans les cultures en gel doit être remplacé tous les 3-4 jours. Veillez à ne pas aspirer d’hydrogels lors du retrait du fluide. En cas de problème, nous vous recommandons d’utiliser une pipette de transfert en plastique. Si l’imagerie par bioluminescence pour suivre le nombre de cellules est prévue, les cellules GBM doivent être transduites avec des lentivirus codant pour l’expression constitutive de la luciférase avant l’encapsulation, comme décrit précédemment3. Pour l’imagerie par bioluminescence, ajouter 1 mM de D-luciférine dans le milieu de culture 1 h avant l’imagerie par luminescence.
