1. Préparation avant les cultures de tranches cérébelleuses organotypiques
- Dans une hotte de culture cellulaire préalablement pulvérisée avec de l’éthanol à 70 %, préparez 200 ml de milieu de culture dans un filtre sous vide de 250 ml fixé à un récepteur de bouteille stérile. Ajouter 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), 50 mL de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 1 mL de 200 mM de L-Glutamine (concentration finale de 1 mM) et 5 mL de glucose de 200 g/L (concentration finale de 5 mg/mL). Filtrez le milieu de culture sous vide et maintenez-le à +4 °C jusqu’à un mois.
- Dans l’enceinte de biosécurité stérilisée, sortez une plaque de culture à 6 puits de son emballage. Remplissez chaque puits avec 1 mL de milieu de culture. Si un traitement est testé, ajoutez l’agent pharmacologique dans le puits traité, et le même volume de solution de véhicule pour le puits de contrôle. Dans la présente étude, nous avons ajouté 1 μL de solution stérile de 3 M de KCl dans le puits traité (30 mM final) et 1 μL d’eau stérile dans les puits témoins.
- Apportez à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire le nombre nécessaire d’inserts de culture cellulaire emballés individuellement avec une membrane hydrophile en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (taille des pores = 0,4 μm). Déballez-les soigneusement et retirez les inserts de culture cellulaire à l’aide d’une pince stérile. Déposez-les un à un dans un puits d’une plaque de 6 puits, en évitant les bulles à l’interface entre la membrane d’insertion et le milieu de culture cellulaire. Laisser les inserts s’équilibrer dans le milieu dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 2 h avant la culture.
note: Le hachoir à tissus réside en permanence dans le capot de culture cellulaire.
- Préparez deux béchers de 200 ml, l’un rempli de 150 ml d’eau stérile et l’autre rempli de 150 ml d’éthanol à 70 %. Trempez les outils chirurgicaux dans le bain d’éthanol à 70 %, puis dans l’eau avant de les utiliser.
note: N’utilisez pas d’outils chirurgicaux immédiatement après un contact avec de l’éthanol.
- Désinfectez la lame à double tranchant dans le bécher à 70 % d’éthanol. Placez-le sur le porte-lame à l’aide d’une pince stérile et maintenez-le en place à l’aide de la clé à serrage. Laissez sécher jusqu’à utilisation.
- Désinfectez le disque en plastique fourni avec le hachoir à tissus dans le bécher à 70 % d’éthanol. Vaporisez la table de découpe avec de l’éthanol à 70 % avant de placer le disque dessus. Laisser sécher jusqu’à utilisation.
2. Dissection et cultures de coupes organotypiques cérébelleuses
- Amenez le bébé souris à l’intérieur du capot de culture cellulaire pour effectuer la dissection.
- Décapitez rapidement le chiot à l’aide de ciseaux droits (figure 1A).
- Tout en tenant la tête du chiot par le nez avec une pince à pansement droite, ouvrez le cuir chevelu à l'aide de ciseaux à œil droits, en commençant par l'extrémité postérieure et en allant latéralement vers la ligne médiane.
- Procéder de la même manière pour le skull.
note: Assurez-vous de pointer les pointes des ciseaux vers l’extérieur pour éviter d’endommager le cervelet pendant la dissection.
- Retirez le cerveau et transférez-le dans une boîte de 60 mm remplie de HBSS froid + 5 mg/mL de glucose.
- Disséquez soigneusement le cervelet à l’aide d’une pince fine droite stérile (Figure 1B). Transférez-le sur le disque en plastique placé sur la table de découpe du hachoir à tissus à l’aide d’une pince fine incurvée stérile.
- Orientez le tissu en tournant la table de découpe pour effectuer des sections parasagittales.
- Déplacez la table de coupe en tirant le bouton de déverrouillage de la table vers la droite, de sorte que la lame soit positionnée sur le bord du tissu.
- Réglez l’épaisseur de la tranche à 350 μm et la vitesse de la lame à moyenne.
- Démarrez le hachoir. Une fois que tout le cervelet a été tranché (Figure 1C), éteignez le hachoir.
- Retirez le disque en plastique à l’aide d’une pince stérile.
- Approchez délicatement le disque en plastique d’une boîte de 60 mm contenant HBSS + 5 mg/mL de glucose. Pipeter HBSS froid + 5 mg/mL de glucose sur le tissu à l’aide d’une pipette de transfert stérile pour permettre le prélèvement de tranches cérébelleuses dans la boîte remplie de tampon.
- Séparez les tranches cérébelleuses les unes des autres à l’aide d’une microsonde. Prélever des coupes de bonne qualité à l’aide de la pipette de transfert (il est recommandé d’utiliser des coupes de tissu proches du vermis) et les déposer dans un insert de culture cellulaire pré-équilibré (Figure 1D).
- Positionnez les tranches cérébelleuses sur l’insert de culture cellulaire à l’aide de la microsonde, puis retirez délicatement l’excès de solution de glucose HBSS + 5 mg/mL à l’aide de la pipette de transfert.
note: À ce stade, les tissus sont extrêmement sensibles et sujets à des dommages physiques. Le nombre maximum de tranches cérébelleuses par insert de culture cellulaire dépend de l’âge de l’animal donneur. 6 à 8 tranches peuvent être cultivées pour un animal âgé de P0 à P4, et 4 à 6 tranches pour les animaux de plus de P5.
- Placez la boîte de culture dans l’incubateur, en changeant complètement le milieu tous les 2 à 3 jours.
- Pour évaluer la survie des cellules de Purkinje, des tranches peuvent être prélevées dès 5 jours in vitro. À d’autres fins, ils peuvent être maintenus en culture pendant plusieurs semaines (Figure 1F).
note: Dans le cas des expériences de survie cellulaire de Purkinje, il n’est pas nécessaire de renouveler le traitement pharmacologique lors du changement de milieu de culture cellulaire (Figure 1F).
3. Immunofluorescence
- Sortez la plaque à 6 puits de l’incubateur. Retirer le milieu de culture cellulaire, laver l’insert de culture cellulaire avec 1x PBS et fixer les tranches avec une solution froide de paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h, avec 1 mL sous l’insert de culture cellulaire et 500 μL sur le dessus de l’insert de culture cellulaire.
- Laver les inserts 4x 10 min avec 1x PBS, avec 1 mL sous et 500 μL sur le dessus de l’insert, sur un agitateur orbital.
- À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches cérébelleuses d'1 insert de culture cellulaire dans 1 puits d’un puits de 24 puits pré-rempli de 1x PBS, 0,25 % de Triton X-100 et 3 % de BSA (PBS-TB), 500 μL/puits.
- Perméabiliser et bloquer les coupes par incubation dans du PBS-TB pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber avec des anticorps primaires dilués dans la solution de PBS-TB, pendant une nuit à + 4 °C, sur un agitateur orbitaire, 200 μL/puits.
- Le lendemain, effectuez quatre lavages de 10 min avec 1x PBS, sur un agitateur orbital, 500 μL/puits.
- Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans la solution de PBS-TB, deux heures à température ambiante, sur un agitateur orbital et à l’abri de la lumière, 200 μL/puits.
- Effectuer quatre lavages de 10 min avec 1x PBS, sur un agitateur orbital, 500 μL/puits.
- Contre-colorer les tranches à l’aide de Hoechst 33342, dilué dans 1x PBS (2 μg/mL), pendant 10 min à température ambiante, à l’abri de la lumière, 500 μL/puits.
- Montez les tranches cérébelleuses sur une lame de microscopie à l’aide d’une pipette de transfert. Laissez-les sécher complètement à l’air, à l’abri de la lumière. Réhumidifiez-les avec 1x PBS et appliquez une lamelle recouverte de quelques gouttes de fluide de montage (~80 μL). Évitez de faire des bulles.
- Une fois que le milieu de montage a durci, les coupes cérébelleuses sont prêtes à être imagées.
4. Imagerie et quantification de la survie cellulaire
- Allumez le microscope et les lasers selon le fabricant.
- Démarrez le logiciel d’acquisition.
- À l’aide d’un objectif 10X, localisez les tranches cérébelleuses non altérées qui présentent 9 à 10 lobules (généralement des sections cérébelleuses proches du vermis).
- Activez l’acquisition z-stack. Définissez l’intervalle de l’empilement z pour inclure toutes les cellules de Purkinje présentes dans la tranche cérébelleuse. Définissez une taille de pas de 2 μm et lancez l’acquisition. Enregistrez l’image acquise dans le format du fabricant du logiciel d’acquisition afin de conserver les métadonnées associées.
- Ouvrez le fichier acquis dans ImageJ à l’aide du plugin Bio-formats.
- Reportez-vous à la section Piles de > d’images > Z-project... (Figure 2A).
- Choisissez Intensité maximale dans le menu déroulant Type de projection et cliquez sur OK (Figure 2B).
- Une image 2D aplatie sera générée. Double-cliquez sur l’outil multipoint pour faire apparaître la fenêtre de l’outil point. Décochez l’option Étiqueter les points pour faciliter la visualisation des cellules comptées. Ensuite, cliquez directement sur un soma d’une cellule de Purkinje pour commencer à compter (Figure 1E). Le nombre total de cellules comptées est indiqué en bas de la fenêtre de l’outil Point (Figure 3).
note: Habituellement, au moins 3 coupes non endommagées contenant 9 à 10 lobules par insert de culture cellulaire peuvent être quantifiées. Pour évaluer l’effet neuroprotecteur d’un agent pharmacologique, au moins 3 expériences indépendantes doivent être réalisées.
