Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Dissection, dissociation et culture des neurones de l’hippocampe chez la souris ou le rat enceinte
- Dissection et dissociation des neurones de l’hippocampe pour la culture
- Décongeler la solution enzymatique de protéase (3 mg/mL de protéase 23 dans la solution de dissection en tranches, SLDS, tableau 1) et le milieu de placage préchauffé (tableau 2) à 37 °C.
- Disséquez l’hippocampe et rincez-le avec SLDS.
note: Quatre hippocampes fournissent suffisamment de cellules pour une plaque à 24 puits ou une plaque à 6 puits.
- Retirer le SLDS, ajouter 2 mL de solution d’enzyme protéase et incuber l’échantillon à 37 °C, 5 % de CO2, pendant 15 min.
- Lavez deux fois les explants d’hippocampe avec 5 à 10 ml de milieu de placage. Ajouter 5 mL de milieu de placage. Dissociez les explants de l’hippocampe en cellules uniques en générant un petit vortex à l’aide d’une pipette munie d’un embout en plastique de 1 ml. Pipetez de haut en bas environ 40 fois, en évitant la formation de bulles d’oxygène, jusqu’à ce que la solution devienne trouble et qu’il ne reste plus de gros morceaux d’explant.
note: N’oubliez pas de laisser un peu de support pendant les lavages, les explants d’hippocampe doivent rester immergés dans le milieu pendant tout le processus.
- Centrifugez les cellules à 1 125 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant avec les cellules immergées dans le milieu. Remettre les cellules en suspension dans 145 mL de milieu de placage. Ajouter 1 mL/puits de suspension cellulaire dans une plaque à 24 puits (3 mL/puits dans une plaque à 6 puits).
REMARQUE : 145 ml de matériau de placage sont utilisés pour produire une suspension cellulaire à faible densité cellulaire. Ce volume permettra de plaquer les cellules en six plaques de 24 puits, huit plaques de 6 puits, ou diverses combinaisons de plaques de 24 ou 6 puits, en fonction des expériences à mener. Chaque puits de la plaque de 24 puits aura environ 3 x 104 cellules.
- Incuber les cellules dans le milieu de placage à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 2 à 4 h, puis retirer tous les supports de placage et les remplacer par des milieux d’entretien frais.
- Après 2 jours (2 jours in vitro, 2DIV), remplacez la moitié du milieu par du 2 μM d’Ara-C (arabinosylcytosine) dissous dans un milieu d’entretien, ce qui inhibe la croissance des fibroblastes, des cellules endothéliales et gliales. Après avoir exposé les cellules à Ara-C pendant deux jours, remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais.
Tableau 1 : Solution de revêtement de lamelle. Fournit la recette de préparation de la solution de revêtement de lamelle utilisée pour faire adhérer les cellules cultivées aux lamelles.
| Solution de revêtement de lamelle |
| 780 μL | Acide acétique17 mM mère : 50 μL d’acide acétique dans 50 mL de H2O |
| 200 μL | Poly-D-lysine (0,5 mg/mL de stock) |
| 20 μL | Collagène de queue de rat (3 mg/mL de bouillon) |
| Le volume total est déterminé en fonction du nombre de lamelles à revêtir. |
Tableau 2 : Recettes de milieux de culture cellulaire. Fournit les recettes de préparation des milieux utilisés dans la culture des cellules neuronales primaires de l’hippocampe.
| 1x Solution de dissection en tranches (SLDS), filtrée, pH= 7,4, stockage à 4 °C |
| 1 L | jjH2O |
| 82 millions d’années | Na2SO4 |
| 30 millions d’euros | K2TB4 |
| 10 millions d’euros | HEPES (acide libre) |
| 10 millions d’euros | D-glucose |
| 5 millions d’euros | MgCl2 |
| 0,00 % | Rouge phénolique (facultatif) |
| Média de placage (PM, filtre, stockage à 4 °C) |
| 439 ml | MEM Sels d'Earle |
| 50 ml | FBS |
| 11,25 ml | 20 % de D-glucose |
| 5 mL | Pyruvate de sodium (100 mM,) |
| 62,5 μL | L-glutamine (200 mM) |
| 5 mL | Pénicilline/streptomycine (P/S, 100x) |
| Média d’entretien (MM, filtre, stockage à 4 °C) |
| 484 ml | Neurobasale |
| 10 ml | B27 50x supplément |
| 1,25 mL | L-glutamine (200 mM) |
| 5 mL | 100 fois par rapport à la traduction |
| Toutes les solutions sont stérilisées à l’aide d’un filtre avec des pores de 0,2 mm. |
