Génération d’une culture organoïde à partir d’une suspension de cellules tumorales cérébrales

Résumé

Source : Sundar, S. J. et al.Maintenir la diversité cellulaire du glioblastome humain ex vivo à l’aide de la culture organoïde tridimensionnelle. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo décrit la préparation et la culture d’organoïdes de tumeurs cérébrales à partir de suspensions unicellulaires. En utilisant une matrice extracellulaire riche en laminines comme échafaudage et milieu de culture pour les nutriments, les cellules sont facilitées à se multiplier et à s’auto-organiser au sein de l’organoïde. Par conséquent, des organoïdes ex vivo sont générés, imitant la diversité cellulaire et le microenvironnement des tumeurs cérébrales.

Protocole

1. Fabrication d’organoïdes à partir d’une suspension unicellulaire

1. Dans un seau à glace ou un bloc froid, placez la matrice extracellulaire riche en laminine (lrECM) et un petit tube à centrifuger. Placez la quantité appropriée de lrECM (16 μL x X nombre d’organoïdes prévus) dans le petit tube à centrifuger.
2. Créez un mélange de cellules d’un volume total (4 μL x X nombre d’organoïdes prévus) contenant 20 000 cellules/organoïde et ajoutez-le dans le petit tube à centrifuger avec lrECM sur glace.
3. Pipeter soigneusement 20 μL du mélange lrECM/suspension cellulaire sur des moules en parafilm, en formant une gouttelette semblable à une perle.
   1. Assurez-vous de bien mélanger le mélange lrECM/suspension cellulaire, car les cellules ont tendance à se déposer facilement dans le lrECM, ce qui donne des organoïdes hétérogènes.
   2. Gardez le mélange lrECM/suspension cellulaire sur de la glace. Si la lrECM se réchauffe, elle peut polymériser et compromettre la formation d’organoïdes.
   3. Assurez-vous de refroidir la pointe de la pipette tous les deux ou trois organoïdes pour éviter la polymérisation de lrECM. N’introduisez pas de bulles d’air dans les organoïdes (évitez de « pousser deux fois » la pointe de la pipette).
4. Une fois que le nombre souhaité d’organoïdes est pipeté sur un moule en parafilm dans une plaque de culture de 10 cm, incuber à 37 °C pendant 1 à 2 h dans un incubateur de culture cellulaire.
5. Une fois que les organoïdes se sont solidifiés, le milieu Neurobasal Media Complete (NBMc) (tableau 1) est utilisé pour les rincer doucement du moule du parafilm et les placer dans une nouvelle plaque de culture stérile de 10 cm avec 20 ml de NBMc au total. L’utilisation d’une pointe Pipette-1000 (p1000) fonctionne mieux pour rincer les organoïdes du moule ; Ils glisseront doucement.
   note: Environ 15 à 20 organoïdes par boîte de culture de 10 cm sont recommandés.
6. Placez la coupelle de culture de 10 cm dans un incubateur (sans secouer) pendant 4 jours.
7. Après 4 jours (Figure 1), remplacez le milieu et placez-le sur un agitateur orbital à 80 tr/min dans l’incubateur de culture cellulaire. Changez de support tous les 2-3 jours par la suite.
   1. L’échange de milieux avec des organoïdes immatures est difficile car ils sont difficiles à visualiser. Inclinez la boîte de culture cellulaire et attendez au moins 20 secondes ; Les organoïdes se déposeront au fond et permettront de retirer lentement le milieu par le haut à l’aide d’une pipette en verre à grande ouverture.
   2. Portez une attention particulière à la collection d’organoïdes au fond ; s’ils semblent agités par la force de l’enlèvement du support, faites une pause et laissez-les se réinstaller. Au fur et à mesure que les organoïdes mûrissent et sont plus faciles à visualiser, ce processus devient moins nuancé.
      note: Parfois, placer un morceau de papier foncé sous la plaque de culture cellulaire peut aider à visualiser les organoïdes immatures. N’utilisez pas de pipette Pasteur avec aspiration sous vide pour retirer le fluide, car il est très facile pour les organoïdes d’être aspirés et perdus de cette façon.
   3. Lorsque les organoïdes sont établis pour la première fois, ils ne consomment pas les milieux aussi rapidement que les organoïdes matures. Commencez par 50 % d’échanges de milieux pour réduire l’utilisation inutile de milieux et réduire le risque d’endommager ou d’aspirer accidentellement de nouveaux organoïdes pendant le processus d’échange de médias.

Tableau 1 : Formulation du milieu neurobasal complet (NBMc)

composant	quantité
Milieu neurobasal sans rouge de phénol	500 ml
Supplément de B-27 moins vitamine A (50x)	10 ml
Antibiotique-antimycosique (100x)	5 mL
Pyruvate de sodium (100 mM)	5 mL
Glutamine à 0,85 % NaCl (200 mM)	5 mL
FGF basique humain recombinant (250 μg/mL)	20 μL
Protéine EFG humaine recombinante (250 μg/mL)	20 μL
Rouge phénolique	500 μL

Résultats

La figure 1 montre la croissance précoce des organoïdes observée par microscopie optique à un grossissement de 10x. La figure 1A montre la migration et l’invasion de cellules uniques via lrECM dans la vue centrale. Les cellules continueront à se développer et à « coloniser » le lrECM, et elles apparaîtront plus denses et finalement opaques par inspection visuelle. La figure 1B montre ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antibiotique-antimycosique	ThermoFisher Scientific	15240062	Antibiotique-antimycosique
Supplément de B-27 moins vitamine A	ThermoFisher Scientific	12587001	Supplément de B-27 moins vitamine A (50x)
Matrigel	ThermoFisher Scientific	354234	Matrice extracellulaire enrichie en laminine
Milieux neurobasaux moins rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	12349015	Milieu neurobasal moins rouge de phénol (500 mL)
Rouge phénolique	sigma	Réf. P0290	Rouge de phénol (0,5 %)
Protéine EGF humaine recombinante	Systèmes de R&D	236-EG-01M	Protéine EGF humaine recombinante (250 μg/mL)
FGF humain recombinant de base	Systèmes de R&D	Référence 4144-TC-01	FGF basique humain recombinant (250 μg/mL)