Différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en oligodendrocytes

Résumé

Source : Assetta, B., et al. Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurones-oligodendrocytes. J. Vis. Exp (2020).

Cette vidéo montre le processus de génération de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) à partir de cellules souches embryonnaires humaines, suivi de la maturation des OPC en oligodendrocytes. Ce processus de génération d'oligodendrocytes ouvre de nombreuses pistes pour améliorer la recherche et le traitement des maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer.

Protocole

1. Induction de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) humaines à partir de cellules souches pluripotentes et maturation des oligodendrocytes

1. Génération de cellules progénitrices neurales (NPC) : protocole monocouche (~7 jours). Voir la figure 1A pour le diagramme.
   1. Utiliser des cellules ES humaines H1 disponibles dans le commerce au passage de 52 (voir le tableau des matériaux). Cultivez les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes d’une solution de matrice extracellulaire (~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits ; voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un milieu de maintenance cellulaire ES (voir le tableau des matériaux) et incubez les plaques à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Trans-différencier les cellules en cellules progénitrices neurales (NPC) par une approche établie appelée SMADi double, avec de petites molécules inhibitrices pour plusieurs voies de signalisation. Ici, nous utilisons un kit commercial largement accepté et suivons le protocole monocouche fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux).
   3. Au jour -1, mettre en boîte 0,5 à 1 x 10⁶ cellules par puits dans une plaque à 6 puits recouverte d’une solution matricielle à facteur de croissance réduit (voir le tableau des matériaux ; ~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits) avec un milieu de maintien des cellules souches embryonnaires (ES) (voir le tableau des matériaux). Cette solution matricielle à facteur de croissance réduit est utilisée pour revêtir toutes les plaques qui seront utilisées dans les étapes suivantes.
   4. Le jour 0, traiter les cellules pendant 24 h avec un milieu d’entretien des cellules ES (voir tableau des matériaux) complété par 2 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   5. Du 1er au 6e jour, remplacer le milieu complet par un milieu d’induction neurale chaud (37 °C) contenant les inhibiteurs de SMAD du kit commercial (voir le tableau des matériaux). Si les cellules se divisent et atteignent la confluence avant le jour 7, faites-les passer à la densité d’ensemencement de 0,5–1 x 10⁶, comme décrit précédemment à l’étape 1.1.3.
   6. Le jour 7, passage des PNJ à l’aide d’une solution de détachement cellulaire (voir tableau des matériaux) et plaque à une densité d’ensemencement de 1–2 x 10⁵ cellules/puits d’une plaque de 24 puits.
   7. Efficacité de la différenciation par coloration immunohistochimique (IHC) pour l’absence de marqueurs de pluripotence, tels que OCT4, et la présence de marqueurs NPC, tels que PAX6, Nestin et Sox1.
   8. À ce stade, les NPC détachés peuvent être congelés dans le milieu de congélation commercial spécialisé (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Après congélation et décongélation pour une fois, les PNJ conservent toujours la multipotence nécessaire pour donner naissance à des neurones, des astrocytes et des OPC avec des protocoles fiables.
2. Génération de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) (~7 jours). Veuillez consulter la figure 1A pour le diagramme.
   1. Le jour 7, faites passer les PNJ à l’aide d’une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux) et plaquez-les à une densité d’ensemencement de 1 à 2 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque de 24 puits dans un milieu d’induction neurale chaud (37 °C) plus des inhibiteurs de SMAD du kit commercial (voir le tableau des matériaux).
   2. Le jour 8, préparer une solution de DMSO à 1 % dans le milieu de différenciation OPC et traiter les NPC plaqués pendant 24 h. Le milieu de différenciation OPC est composé d’un milieu basal (DMEM/F12), d’un supplément de 1 % de N2, d’un supplément de 1 % de B27, d’un facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) à 20 ng/mL, d’un agoniste lissé (SAG) à 1 μM, d’un facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA) à 10 ng/mL (voir le tableau des matériaux).
   3. Le jour 9, remplacez le support par un nouveau support de différenciation OPC sans DMSO. Nourrissez les cellules tous les deux jours jusqu’au 15e jour. Si les cellules atteignent la confluence avant le jour 15, faites-les passer à la densité d’ensemencement de 1 à 2 x 10⁵ cellules par puits, comme décrit à l’étape 1.2.1.
   4. Au jour 14, les OPC sur plaque dans un milieu de différenciation des OPC à une densité de 1–2 x 10⁵ cellules/puits dans une plaque à 24 puits.
   5. À ce stade (jour 15), tester les cellules pour détecter la présence de marqueurs spécifiques des OPC par coloration immunohistochimique (IHC) ou réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) (p. ex., O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa ; Graphique 1B) et pour l’absence de marqueurs NPC (Pax6 ou Nestin ; Figure 1D). Nous détectons généralement l’immunoréactivité O4 dans plus de 95 % des cellules au 15e jour. L'expression de l'APP (protéine précurseur de l'amyloïde), de BACE1 (la protéase de traitement β-sécrétase 1) et du peptide amyloïde-β (Aβ) est abondante dans les OPC (Figure 1F).
3. Maturation des oligodendrocytes (OL) (~7 à 20 jours)
   1. Au jour 15, remplacer le milieu par un milieu de maturation OL : milieu neurobasal-A, supplément de 2 % de B27, 1 μM d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), 200 ng/mL de triiodothyronine T3 et clémastine de 1 μM (voir le tableau des matériaux). Changez de support tous les deux jours ou tous les jours, si nécessaire.
   2. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, divisez-les dans un rapport de 1:3 jusqu’à 2 passages ou jusqu’à ce que la division cellulaire ralentisse considérablement. Si les OPC se divisent trop rapidement et atteignent leur confluence en moins de 3 jours, ajoutez Ara-C (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 2 à 5 μM pendant 1 à 3 jours. La prolifération active indique une diminution de l’efficacité de la maturation.
   3. Examinez l’efficacité de la maturation oligodendrogliale en évaluant l’expression des marqueurs OL, par exemple, CLDN11, PLP1, MBP par qPCR, coloration IHC ou immunoblottage. La morphologie caractéristique de structures très complexes (figure 1C) et l’expression des marqueurs OL (figure 1E) devraient être facilement détectées au jour 28.

Résultats

Figure 1 : Génération d’iOPC (cellules précurseurs d’oligodendrocytes induits) et maturation d’iOL (oligodendrocytes induits). (A) Organigramme de la production d’iOPC et d’iOL. (B) Images représentatives en fond clair et en immunofluorescence des iOPC au jour 15. Olig2 (marqueur pan-oligodendroglia) est représenté en vert, O4 (marqueur OPC) en rouge et DAPI e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accutase	Technologies STEMCELL	Référence 7920
Supplément B27	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
camp	MilliporeSigma	A9501
Clémastine	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 moyen	Technologies STEMCELL	Référence 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Sérum fœtal bovin	ScienCell	10
H1 cellules ES humaines	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Technologies STEMCELL	Référence 5825
Supplément N2	ThermoFisher	17502001
Neurobasale A moyenne	ThermoFisher	Référence 10888-022
Acides aminés non essentiels	ThermoFisher	Référence 11140-050
PDGF-AA	Systèmes de R&D	Référence 221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene	Référence 12251
Polybrène	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	Référence 12253
Inhibiteur de ROCK Y-27632	Technologies STEMCELL	Référence 72302
fléchir	Tocris	N° 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media	Technologies STEMCELL	Référence 5838
Kit d’induction neuronale STEMdiff SMADi	Technologies STEMCELL	Référence 8581
T3 triiodothyronine	MilliporeSigma	Réf. T6397
Tempo-iOlogo : OPCs humains dérivés d’iPSC	Tempo BioScience	Réf.102
TetO-NG2-Puro	Addgene	Référence 52047
VSV-G	Addgene	Référence 12259