$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Induction de neurones humains à partir de cellules souches pluripotentes humaines
- Préparation du lentivirus (~5 jours)
- Plaquez ~1 million de cellules de rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) chaque fiole T75, pour les avoir ~40 % confluentes lors de la transfection. Transfectez-les avec des plasmides exprimant la neurogénine 2 induite par la tétracycline (Ngn2) et le gène résistant à la puromycine (PuroR ; sous le même contrôle du promoteur de l’opérateur Tet (TetO), le transactivateur inverse de la tétracycline (rtTA) et les trois plasmides auxiliaires pRSV-REV, pMDLg/pRRE et VSV-G (12 μg d’ADN du vecteur lentiviral et 6 μg de chacun de l’ADN plasmidique auxiliaire). Préparez au moins trois flacons par préparation de lentivirus. Utilisez de la polyéthylénimine (PEI) pour la transfection en suivant les instructions du fabricant. Changez le support après 16 h et jetez-le.
- Récoltez les particules virales libérées en recueillant des milieux de culture tous les jours et remplacez-les par des milieux frais pendant 3 jours. Regrouper les milieux collectés contenant des particules virales pour la purification. Filtrer le virus à travers un filtre de 0,22 μm et centrifuger à 49 000 x g pendant 90 min. Remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de glucose salin tamponné au phosphate (PBS) (~150 μL).
- Induction neuronale (~5 jours)
note: Ce protocole d’induction (Figure 1A ; diagramme de flux) est très efficace pour les cellules souches pluripotentes induites (iPS) et les cellules souches embryonnaires (ES) de pluripotence validée (qui peuvent être testées par coloration immunohistochimique de marqueurs de pluripotence bien caractérisés ; Figure 1B).
- Utiliser des cellules ES humaines H1 disponibles dans le commerce au passage de 52 (voir le tableau des matériaux). Cultivez les cellules sur des plaques à 6 puits revêtues d’une solution de matrice extracellulaire (~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits ; voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un milieu de maintenance cellulaire ES (voir le tableau des matériaux) et incubez les plaques à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Le jour -2, détacher les cellules ES (80 % confluentes) avec 1 mL de solution de décollement cellulaire (voir le tableau des matériaux) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Transvaser les cellules dans un tube ; laver le puits avec 2 mL de milieu et combiner dans le même tube. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, remettre la pastille en suspension dans le milieu et déposer les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes de matrice à une densité d’ensemencement de 1 x 105 cellules par puits.
- Au jour -1, ajouter les lentivirus exprimant Ngn2 plus PuroR et rtTA avec du polybrène (8 μg/ml) aux cellules ES dans un milieu frais d’entretien des cellules ES (voir le tableau des matériaux). Le nombre exact de virus doit être déterminé par les titres réels ou le titrage. Nous ajoutons généralement 5 μL par virus par puits dans une plaque à 6 puits.
- Le jour 0, ajouter de la doxycycline (2 μg/mL, pour activer l'expression de Ngn2) dans le milieu modifié Eagle de Dulbecco et le mélange de nutriments F-12 (DMEM-F12) avec un supplément de N2 sans morphogènes.
- Le jour 1, ajouter Puromycine dans un milieu frais de DMEM-F12 plus N2 et de doxycycline, jusqu’à la concentration finale de 1 μg/mL de milieu. Sélectionner les cellules transduites dans Puromycine pendant au moins 24 h. Une concentration plus élevée de Puromycine (jusqu’à 5 μg/mL) et une période de sélection plus longue (jusqu’à 48 h) peuvent être nécessaires pour éliminer adéquatement les cellules sous-transduites si le titre de virus est faible.
- Le jour 2, détachez les neurones différenciateurs avec une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux), et replaquez-les sur des plaques à 24 puits (entre 80 000 et 200 000 cellules/puits) recouvertes d’une solution matricielle (voir le tableau des matériaux), et maintenez-les dans un milieu neurobasal-A (NBA)/B27 sans doxycycline. La densité de semis est cruciale.
- À ce stade, les neurones détachés peuvent être congelés dans un milieu de congélation commercial spécialisé (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Les neurones purs peuvent être mis en boîte, ce qui représente la mort cellulaire typique de ~15 à 20 % après la décongélation, cultivés seuls ou co-cultivés avec d’autres types de cellules cérébrales (voir l’étape 3.2.3. pour la co-culture avec des OPC).
- Cultivez des iN purs sur des plaques recouvertes de solutions à base de matrice extracellulaire selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). La morphologie pyramidale caractéristique devrait être apparente au jour 4 (et au jour 6 ; Figure 1C). La formation des synapses peut être détectée dès le 14e au 16e jour et est proéminente au 24e jour par coloration immunohistochimique avec des marqueurs pré- et post-synaptiques standard. (Figure 1D ; étiqueté avec le marqueur pré-synaptique Synapsine 1 et le marqueur dendritique Map2).
2. Induction de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) humaines à partir de cellules souches pluripotentes et maturation des oligodendrocytes
- Génération de cellules progénitrices neurales (NPC) : protocole monocouche (~7 jours). Voir la figure 2A pour le diagramme.
- Cultiver des cellules ES humaines H1 comme décrit précédemment (voir étape 1.2.1.) et les transdifférencier en cellules progénitrices neurales (NPC) par une approche établie appelée SMADi dual, avec de petites molécules inhibitrices pour plusieurs voies de signalisation. Ici, nous utilisons un kit commercial largement accepté et suivons le protocole monocouche fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Au jour -1, mettre sur plaque 0,5 à 1 x 106 cellules par puits dans une plaque à 6 puits recouverte d’une solution matricielle à facteur de croissance réduit (voir le tableau des matériaux ; ~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits) avec un milieu de maintenance des cellules ES (voir le tableau des matériaux). Cette solution à matrice réduite en facteur de croissance est utilisée pour revêtir toutes les plaques qui seront utilisées dans les étapes suivantes.
- Le jour 0, traiter les cellules pendant 24 h avec un milieu d’entretien des cellules ES (voir tableau des matériaux) complété par 2 % de DMSO.
- Du 1er au 6e jour, remplacer le milieu complet par un milieu d’induction neurale chaud (37 °C) contenant les inhibiteurs de SMAD du kit commercial (voir le tableau des matériaux). Si les cellules se divisent et atteignent la confluence avant le jour 7, faites-les passer à la densité d’ensemencement de 0,5–1 x 106, comme décrit précédemment à l’étape 2.1.2.
- Le jour 7, passage des PNJ à l’aide d’une solution de détachement cellulaire (voir tableau des matériaux) et plaque à une densité d’ensemencement de 1–2 x 105 cellules/puits d’une plaque de 24 puits.
- Testez l’efficacité de la différenciation par coloration immunohistochimique (IHC) pour l’absence de marqueur de pluripotence, le facteur de transcription 4 de liaison à l’octamère (OCT4) par exemple, et la présence de marqueurs NPC tels que la boîte appariée 6 (PAX6), Nestin et le facteur de transcription 1 de la région Y-box déterminant le sexe (Sox1).
- À ce stade, les NPC détachés peuvent être congelés dans le milieu de congélation commercial spécialisé (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Après congélation et décongélation pour une fois, les PNJ conservent toujours la multipotence nécessaire pour donner naissance à des neurones, des astrocytes et des OPC avec des protocoles fiables.
- Génération de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) (~7 jours). Veuillez consulter la figure 2A pour le diagramme.
- Le jour 7, faites passer les PNJ à l’aide d’une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux) et plaquez-les à une densité d’ensemencement de 1 à 2 x 105 cellules par puits dans une plaque de 24 puits dans un milieu d’induction neurale chaud (37 °C) plus des inhibiteurs de SMAD du kit commercial (voir le tableau des matériaux).
- Le jour 8, préparer une solution de diméthylsulfoxyde à 1 % (DMSO) dans le milieu de différenciation des OPC et traiter les NPC plaqués pendant 24 h. Le milieu de différenciation OPC est composé de : milieu DMEM/F12, supplément de 1 % de N2, supplément de 1 % de B27, facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) à 20 ng/mL, agoniste lissé (SAG) à 1 μM, facteur de croissance dérivé des plaquettes-AA (PDGF-AA) à 10 ng/mL (voir tableau des matériaux).
- Le jour 9, remplacez le support par un nouveau support de différenciation OPC sans DMSO. Nourrissez les cellules tous les deux jours jusqu’au 15e jour. Si les cellules atteignent la confluence avant le jour 15, faites-les passer à la densité d’ensemencement de 1 à 2 x 105 cellules par puits, comme décrit à l’étape 2.2.1.
- Au jour 14, les OPC sur plaque dans un milieu de différenciation des OPC à une densité de 1–2 x 105 cellules/puits dans une plaque à 24 puits.
- À ce stade (jour 15), tester les cellules pour détecter la présence de marqueurs spécifiques de l’OPC par coloration IHC ou qPCR (p. ex., O4, facteur de transcription de la lignée des oligodendrocytes [Olig]-1/2, protéoglycane 4 du sulfate de chondroïtine/antigène glial neuronal-glial 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes [PDGFRa] ; Graphique 2B) et pour l’absence de marqueurs NPC (Pax6 ou Nestin ; Figure 2D). Nous détectons généralement l’immunoréactivité O4 dans plus de 95 % des cellules au jour 15. L’expression de l’APP (protéine précurseur de l’amyloïde), de BACE1 (la protéase de traitement β-secréatase 1) et du peptide amyloïde-β (Aβ) est abondante dans les OPC (Figure 2F).
3. Co-culture de neurones induits humains (iNs) et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (iOPCs)
- Placage iOPC (~3 jours)
- Plaque iOPC au jour 14 à une densité de 1 x 105 cellules par puits dans une plaque à 24 puits (comme décrit ci-dessus à l’étape 2.2.4.) dans un milieu de différenciation OPC (comme décrit à l’étape 2.2.2.).
- Mise en place de la co-culture iN-iOPC
- Au jour 15, détachez les neurones humains induits à l’étape du jour 2 après la sélection de la puromycine (comme décrit à l’étape 1.2.6.) avec une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux).
- Ajoutez des neurones sur les OPC en culture, en plaquant à la densité d’ensemencement de 2 x 105 cellules par puits dans la plaque de 24 puits avec des OPC en croissance (à partir de l’étape 3.1.1). Utilisez le milieu de co-culture contenant du milieu Neurobasal-A, un supplément de 2 % de B27 et 100 ng/mL de triiodothyronine T3. Changez de support le lendemain, puis tous les deux jours par la suite. Si les OPC prolifèrent trop rapidement et atteignent leur confluence en moins de 3 jours, ajoutez de la cytosine arabinoside (Ara-C) à une concentration de 2 à 5 μM. La figure 3A montre une image représentative des iN et des iOPC cultivés en co-culture après 7 jours de neurones.
- Utilisez des neurones congelés préparés comme décrit ci-dessus à l’étape 1.2.7 pour la co-culture avec des OPC. Des neurones de congélation et de décongélation en plaques à une densité plus élevée de 3 x 105 cellules par puits.
- Après les jours 14 à 16 dans les co-cultures, la formation des synapses dans les iN peut être observée par coloration IHC des marqueurs pré- et post-synaptiques, et au jour 21, les points synaptiques devraient être abondants (Figure 3C) et les activités neuronales peuvent être enregistrées de manière fiable.
- À partir du jour 21, testez les cellules pour détecter des marqueurs spécifiques de la LO (par exemple, la protéine basique de la myéline [MBP] et la protéine protéolipide 1 [PLP1]). Au jour 28, nous observons normalement le phénomène d’engainement des axones iN par les processus iOL, marqués par coloration IHC pour des marqueurs spécifiques (Figure 3B ; neurofilament [NF] pour les axones iN et MBP pour les processus iOPC).
