1. Préparation expérimentale
- Préparer des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale (BMM).
note: Le BMM se solidifie plus rapidement à des températures plus chaudes. Les plaques doivent être préparées rapidement et placées immédiatement à 4 °C pour le stockage.
- Décongeler le BMM (voir le tableau des matériaux) sur de la glace, à 4 °C pendant au moins 2 h, ou toute la nuit.
- Mélanger le milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco et le BMM à une concentration finale de 80 μg/mL. Répartir la solution de BMM dans des boîtes de culture tissulaire (1 mL pour les boîtes de 35 mm et 2 mL pour les boîtes de 60 mm) et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de mettre les cellules en boîte.
REMARQUE : La vaisselle non utilisée peut être conservée à 4 °C pendant 2 semaines.
- Préparez des plaques recouvertes de poly-L-ornithine/laminine (PLO/laminin).
- Préparez 20 μg/mL de PLO (voir le tableau des matériaux) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (DPBS+/+) et ajoutez 1 mL dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Incuber une nuit à 37 °C dans l’incubateur.
- Le lendemain, aspirez le PLO avec un aspirateur et lavez-le deux fois avec DPBS+/+. Sécher à l’air libre dans la hotte.
REMARQUE : Les plaques séchées à l’air peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines, enveloppées dans du papier d’aluminium, pour une utilisation future.
- Préparez 10 μg/mL de laminine (voir le tableau des matériaux) dans DPBS+/+ et ajoutez 1 mL dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber au moins 3 h ou toute la nuit à 37 °C dans l’incubateur.
- Aspirez la laminine à l’aide d’un aspirateur sous vide et ajoutez 1 mL de DPBS+/+.
de support ou stérile
REMARQUE : Le revêtement de laminine ne doit pas se dessécher. Le PBS ou un milieu de culture approprié doit être ajouté immédiatement pour éviter cela. Les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparez la solution de passage PSC.
- Dissoudre 11,49 g de chlorure de potassium (KCl) et 0,147 g de citrate de sodium dihydraté (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) dans 400 mL d’eau stérile de qualité culture cellulaire (voir le tableau des matériaux).
- Mesurez le volume de la solution et enregistrez-le comme volume initial (Vi).
- Mesurez l’osmolarité et ajustez-la à 570 mOsm en ajoutant de l’eau stérile de qualité culture cellulaire à l’aide de la formule Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Stérilisez la solution avec un filtre de 0,20 μm et faites des aliquotes de 10 mL. Conservez les aliquotes à température ambiante (RT) jusqu’à 6 mois.
- Préparer le milieu de cellules souches pluripotentes (CSP).
REMARQUE : Les iPSC sont maintenus dans un milieu contenant du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) thermostable (voir le tableau des matériaux), ce qui permet de s’alimenter sans week-end. D’autres supports PSC disponibles dans le commerce n’ont pas été testés pour ce protocole.
- Décongeler le supplément PSC medium pendant la nuit à 4 °C.
- Ajouter 10 ml de supplément de milieu PSC à 500 ml de milieu PSC basal. Préparer 25 mL d’aliquotes et les conserver à −20 °C.
REMARQUE : Les aliquotes congelées peuvent être conservées à −20 °C pendant 6 mois. Les aliquotes décongelées doivent être conservées à 4 °C et utilisées dans les 2 semaines. Les cellules peuvent être congelées pour un stockage à long terme dans un milieu PSC avec 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Préparez le milieu de décongélation PSC.
- Complétez le milieu PSC avec du chromane 50 nM, 1,5 μM d’emricasan, 1x supplément de polyamine et 0,7 μM trans-ISRIB (cocktail CEPT) (voir tableau des matériaux).
- Stériliser par filtre avec un filtre de 0,20 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 4 semaines.
- Préparez des pipettes en verre tiré.
- Tirez les pipettes Pasteur en verre de 22,9 cm (9 po) en deux morceaux au-dessus d’un bec Bunsen, à ~2 cm sous le goulot, en créant deux pipettes, le côté le plus fin étant ~4 cm plus court que l’autre.
- À l’aide de la flamme, pliez les pointes du côté tiré pour créer un « r » lisse.
- Placez les pipettes tirées dans les manchons de l’autoclave et l’autoclave pour la stérilisation.
- Préparez le milieu de différenciation cérébelleuse (CDM).
- Mélangez le milieu modifié Dulbecco's d'Iscove (IMDM) et le mélange nutritif F12 de Ham dans un rapport de 1:1. Complétez le mélange avec 1 supplément de L-alanine-L-glutamine, un concentré de lipides chimiquement définis à 1 % (v/v), 0,45 mM de 1-thio-glycérol, 15 μL/mL d’apo-transferrine, 5 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 7 μg/mL d’insuline (voir le tableau des matières).
- Stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans un délai de 1 mois.
- Préparez le milieu de maturation cérébelleuse (CMM).
- Complétez le milieu neurobasal avec 1x supplément de L-alanine-L-glutamine et 1x supplément de N-2 (voir le tableau des matériaux).
- Stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans les 2 semaines.
2. Culture d’iPSC sans feeder
- Décongelez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez une plaque BMM (étape 1.1) dans l’incubateur à 37 °C pour qu’elle gélifie pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de décongeler les cellules.
- Préchauffer 10 ml de produit de décongélation PSC (étape 1.5) à 37 °C.
- Transférez le cryoflacon avec des cellules de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.
REMARQUE : Pour éviter de générer une source de contamination dans l’espace de culture cellulaire, l’utilisation d’un bain-marie standard n’est pas recommandée. Au lieu de cela, l’eau douce peut être chauffée dans un petit bécher à 37 °C pour générer un bain-marie à usage unique.
- Lorsqu’il reste un petit morceau de glace dans le tube, retirez-le du bain-marie, séchez le tube et vaporisez de l’éthanol à 70 %. Transférez le tube dans le capuchon et utilisez une pipette sérologique de 2 mL ou 5 mL (voir le tableau des matériaux) pour transférer doucement les cellules dans un tube conique de 15 mL.
- Ajouter 8 ml de milieu de décongélation PSC aux cellules dans le sens de la goutte à goutte tout en faisant tourner le tube conique. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sans perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de décongélation PSC.
- Aspirez le BMM de la plaque et ajoutez les cellules remises en suspension goutte à goutte sur toute la plaque pour une distribution uniforme.
- Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % CO2. Rafraîchissez le support le lendemain avec le support PSC. Après cela, changez de support tous les jours.
- Conservez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.
- Préchauffer le volume nécessaire de milieu PSC à 37 °C (p. ex., 1 mL de milieu par plaque de 35 mm).
- Examinez les plaques à la recherche de cellules ou de colonies différenciées et retirez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré (étape 1.6).
REMARQUE : Les colonies d’iPSC ont des bords lisses avec des cellules morphologiquement identiques.
- Changez le milieu épuisé tous les jours et passez tous les 3-4 jours ou lorsque la confluence de 70 % est atteinte.
- Passage des cellules.
- Placez la quantité nécessaire de plaques BMM dans l’incubateur pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de passer. Préchauffez la quantité nécessaire de milieu PSC (étape 1.3) à 37 °C.
- À l’aide d’une pipette en verre tiré, nettoyez toutes les cellules ou colonies différenciées.
- Aspirer le milieu usé à l’aide d’un aspirateur et ajouter le milieu de dissociation PSC, 1 mL par plat de 35 mm. Incuber à 37 °C pendant 1 à 3 min
REMARQUE : Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter le milieu PSC, le temps d’incubation peut être réduit.
- Aspirez la solution de passage PSC et ajoutez un milieu PSC préchauffé.
- À l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL, grattez les lignes parallèlement les unes aux autres dans une direction, tournez la plaque à 90° et faites une deuxième série de lignes de grattage perpendiculaires aux précédentes (en formant un motif hachuré sur la plaque).
- Aspirez la solution BMM à partir des plaques de réglage. Prélever les colonies à l’aide d’une pipette sérologique et les distribuer sur de nouvelles plaques BMM.
- Incuber à 37 °C, 5 % CO2. Changez de support tous les jours.
- Congelez les cellules.
- Préparez les cryoflacons en étiquetant le contenu et stérilisez-les sous la lumière ultraviolette (UV) dans le capot (voir le tableau des matériaux) pendant 30 min.
- Préparez le milieu de congélation PSC en complétant le milieu PSC avec 10 % (v/v) de DMSO. Suivez les étapes 2.3.2 à 2.3.5.
- Transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL avec une pipette sérologique de 5 mL et centrifugez à 200 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirez soigneusement le fluide et mettez en suspension la pastille cellulaire dans le fluide de congélation PSC.
- Distribuer dans des cryoflacons. Placez les flacons dans un récipient de congélation et placez le récipient dans un congélateur à -80 °C.
- Le lendemain, transférez les cryoflacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
3. Différenciation cérébelleuse
REMARQUE : Avant de commencer la différenciation, les iPSC sont passées dans six boîtes de 35 mm et sont prêtes pour la différenciation lorsqu’elles sont à 70 % de confluence. Chaque plaque de 35 mm sera transférée dans un puits de la plaque de 6 puits.
- Le jour 0, soulevez les colonies d’iPSC saines pour la formation d’EB.
- Ajouter 1 mL de MDP (étape 1.7) complété par 10 μM d’Y-27632 et 10 μM de SB431542 (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits d’une plaque à fixation ultra-faible (ULA) à 6 puits et placer dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies soulevées soient prêtes à être ajoutées aux puits.
- Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré. Aspirer le milieu et ajouter 1 mL de solution de passage PSC pour chaque parabole de 35 mm. Incuber pendant 3 min à 37 °C, aspirer et ajouter 2 mL de CDM complété par 10 μM Y-27632 et 10 μM SB431542.
note: Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter le CDM, le temps d’incubation peut être réduit.
- Sous un microscope inversé à lumière transmise, soulevez doucement les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tirée avec un grossissement de 4x. Une fois que chaque colonie est prélevée, transférez doucement le tout dans un puits de la plaque ULA à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
note: Si les colonies sont trop grandes ou sont fusionnées, elles peuvent être tranchées avec la pointe de la pipette en verre tiré pour créer des EB plus petits.
- Le jour 2, ajouter du FGF2 dans chaque puits jusqu’à une concentration finale de 50 ng/mL.
note: Le FGF2 utilisé pour la différenciation cérébelleuse n’est pas stable à la chaleur. Ce protocole n’a pas été testé avec un FGF2 thermostable.
- Le jour 7, faites un changement de 1/3 de moyen. Pour 3 ml de milieu total dans un puits, à l’aide d’une pipette de 1 000 μL, aspirez doucement 1 ml de milieu usagé et remplacez-le par 1 ml de CDM frais. Incuber les EB pendant 7 jours.
- Le 14e jour, aspirez doucement presque tout le milieu épuisé à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Pour minimiser les dommages aux EB, faites tourner la plaque pour rassembler tous les EB au centre de la plaque, puis inclinez la plaque et aspirez lentement à partir du bord.
- Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer. Laissez suffisamment de milieu pour éviter de dessécher les EB. Ensuite, ajoutez 3 ml de CDM frais complété par 10 μM de Y-27632. Transférez les EB à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL dans une boîte recouverte de PLO ou de laminine (étape 1.2).
note: En fonction de l’application en aval, les EB peuvent être transférés sur une plaque PLO/laminine à 6 puits ou des EB simples peuvent être transférés sur un seul puits d’une plaque ou d’une lamelle à 24 puits recouverte de PLO/laminine.
- Le 15e jour, aspirez le milieu et remplacez-le par du CDM.
frais
note: Il est important d’ajouter suffisamment de milieu dans les puits pour assurer une quantité suffisante de milieu entre les repas, car avec le temps, il y aura une évaporation (p. ex., pour un puits dans une plaque à 6 puits, ajouter 3 mL de milieu). Si le milieu a commencé à s’acidifier (devenir clair et jaune), rafraîchissez le milieu même s’il n’est pas sur le calendrier d’alimentation jusqu’à la fin du protocole.
- Le 21e jour, aspirez le support usagé et remplacez-le par une MMT. Le jour 28, changez de milieu avec de la MMT fraîche. Le 35e jour, récoltez les cellules pour d’autres applications.
