Génération de neurones et de cellules gliales à partir de corps embryoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Source : Pistollato, F., et al. Protocole pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cultures mixtes de neurones et de cellules gliales pour les tests de neurotoxicité. J. Vis. Exp.(2017)

Cette vidéo démontre le processus de différenciation des corps embryoïdes (EB) en agrégats neuroépithéliaux et leur division ultérieure en cellules neuronales et gliales. Cette méthode permet de générer efficacement des cellules neuronales et gliales in vitro, qui servent de systèmes d’essai pour les tests de toxicité ainsi que pour l’évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité.

Protocole

1. Différenciation des HiPSC en neurones mixtes et glie

REMARQUE : La procédure dure environ 28 jours, les principales étapes étant décrites à la figure 1.

1. Génération de corps embryoïdes (EB) (Jours 0 → 1)
   REMARQUE : Cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de la précision. Les fragments de colonie de cellules souches pluripotentes induites humaines (cellules souches pluripotentes induites humaines) doivent être de taille égale pour obtenir des corps embryoïdes (EB) homogènes dans les prochaines étapes. Les colonies morphologiquement différenciées (avec de grandes fractions cytoplasmiques et de petits nucléoles) doivent être éliminées.
   1. Rafraîchir le milieu de cellules hiPSC (boîte de Pétri de 3 mL/60 mm) avant de couper les colonies de cellules hiPSC indifférenciées (environ 1 mm de diamètre, voir la figure 2A) dans des conditions stériles.
   2. Couper les colonies indifférenciées (comme illustré à la figure 2A et à la figure 2B) en fragments d’environ 200 μm x 200 μm à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 30 G. Utilisez un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4X dans une armoire à flux laminaire à température ambiante.
   3. Détachez les fragments de colonie de la surface de la boîte à l’aide d’une pipette de 200 μL en pipetant doucement le milieu en dessous pour soulever les morceaux.
   4. Transférez tous les fragments détachés et le milieu dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette de 1, 2 ou 5 ml.
   5. Rincez le plat avec 2 ml de milieu hiPSC complet pour récupérer tous les fragments.
   6. Centrifugeuse à 112 x g pendant 1 min.
   7. Aspirer le surnageant et remettre doucement les fragments en suspension dans 5 mL de milieu hiPSC EB complet (voir le tableau des matériaux).
   8. Placez les fragments de colonie dans une boîte de Pétri de 60 mm à très faible fixation (boîte de Pétri de 5 ml/60 mm).
   9. Incuber la boîte de Pétri pendant la nuit à 37 °C et 5 % CO₂.
   10. Le lendemain (jour 1), prélevez les EB et leur milieu dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette de 1, 2 ou 5 ml.
   11. Centrifuger les EB à 112 x g pendant 1 min.
   12. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez doucement les EB en suspension dans 5 mL de milieu EB hiPSC complet à l’aide d’une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   13. Replaquez les EB sur une nouvelle boîte de Pétri de 60 mm à fixation ultra-basse (boîte de Pétri de 5 ml/60 mm).
   14. Incuber la boîte de Pétri pendant la nuit à 37 °C et 5 % CO₂.
2. Le jour 1, enduire les plats d’une matrice de membrane basale (par exemple, matrigel, ci-après appelée « matrice standard ») ou de tout autre substrat protéique approprié (par exemple, laminine).
   1. Stocker la matrice étalon (voir le tableau des matériaux) à -80 °C dans des aliquotes de 200 μL à l’aide de tubes froids de 1,5 mL et de pipettes froides de 5 ou 10 mL.
   2. Décongeler 200 μL de matrice standard sur de la glace.
   3. Diluer 200 μL de matrice étalon dans 20 mL de milieu basal (DMEM/F12) (dilution 1:100).
   4. Enduire des boîtes de Pétri de 60 mm avec cette solution (5 ml/boîte).
   5. Incuber les plats enrobés à 37 °C pendant la nuit.
      note: Ces boîtes serviront à plaquer les EB (environ 50 EBs/boîte) et à générer des agrégats neuroépithéliaux (rosettes) ; Voir l’étape 1.3.
3. Génération d’agrégats neuroépithéliaux (rosettes) (jours 2 → 7)
   1. Le jour 2, retirer la solution de revêtement matriciel standard des boîtes de Pétri de 60 mm (pas besoin de rincer les plaques) et les remplir avec 5 ml/boîte de milieu d’induction neuroépithéliale complet (NRI) ; voir le tableau des matériaux.
   2. Transférez les EB flottants (à partir de l’étape 1.1.14) dans des boîtes revêtues (~50 EBs/plat) à l’aide d’une pipette de 200 μL sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4x et placée dans une armoire à flux laminaire.
      note: Il est essentiel de sélectionner des EB homogènes de taille moyenne (~200-300 μm de diamètre). Les EB trop petits peuvent ne pas bien survivre lors de la différenciation neuroectodermique, tandis que les EB trop gros ont tendance à subir une nécrose centrale.
   3. Incuber les plats à 37 °C et 5 % de CO₂.
   4. Le lendemain (jour 3), vérifiez les paraboles au microscope à un grossissement de 10x pour vous assurer que les EB sont tous fixés.
   5. Effectuez en douceur un changement total de support avec un milieu NRI complet.
   6. Changez le milieu NRI tous les deux jours jusqu’au jour 7, lorsque les agrégats neuroépithéliaux (rosettes) devraient être visibles.
   7. Le jour 7, enduire une matrice étalon (ou laminine), comme décrit à l’étape 1.2, sur n’importe quel format de plaque ou de plat requis : plaques à 96 puits (100 μL/puits), plaques à 24 puits (250 μL/puits), plaques à 12 puits (500 μL/puits), puces MEA (pour l’activité électrique, 1 mL/puce à un puits) ou boîtes de Pétri de 60 mm (4 mL/boîte).
   8. Incuber les plaques/plats revêtus pendant au moins 2 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Dissociation de la rosette et différenciation neuronale (Jours 8 → 28)
   REMARQUE : Cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de la précision. Pour éviter de collecter des cellules mésodermiques et endodermiques, seules les structures ressemblant à des rosettes d’ectoderme doivent être dissociées et collectées.
   1. Le jour 8, coupez les structures en forme de rosette en fragments sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de 10X dans des conditions stériles. Utilisez une seringue de 1 ml avec une aiguille de 30 G. Notez que les rosaces ont tendance à se détacher du plat lorsqu’elles sont touchées facilement avec l’aiguille.
   2. Complétez le détachement des fragments de rosette à l’aide d’une pipette de 200 μL.
   3. Transférez la parabole sous la hotte à flux laminaire et recueillez les fragments de rosette et leur milieu dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pipette de 1, 2 ou 5 ml. Rincez le plat avec 2 ml de milieu NRI pour récupérer tous les fragments.
   4. Faites tourner les fragments de rosette à 112 x g pendant 2 min.
   5. Aspirez le surnageant.
   6. Remettez doucement la pastille en suspension dans 1 mL de 1x DPBS (sans calcium ni magnésium) et pipetez doucement les fragments de rosette de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 000 μL pour les dissocier partiellement.
   7. Ajouter 4 mL de milieu NRI complet et compter les cellules à l’aide de bleu de trypan et d’un compteur de cellules automatisé (voir le Tableau des matières)
      note: Diluer 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu de trypan. Cette étape peut être omise si les cellules ne peuvent pas être amenées dans une suspension unicellulaire. Si les fragments de rosette ne semblent pas complètement dissociés, les fragments de rosette provenant d’environ 50 EB/boîte de 60 mm peuvent être remis en suspension dans 50 mL de milieu NRI complet et plaqués, comme indiqué dans le tableau 1.
   8. Aspirer la solution de revêtement de matrice standard (ou laminine) des boîtes de Pétri, des plaques et/ou des puces MEA (à partir de l’étape 1.3.7). Ne les laissez pas sécher.
   9. Plaquez les cellules dans un milieu NRI complet selon le plan d’étude (environ 15 000 cellules/^cm2 ; voir le tableau 1 pour les indications de volume de placage).
   10. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C et 5 % CO₂.
   11. Le jour 10, effectuez un changement total de milieu à l’aide d’un milieu de différenciation neuronale (ND) complet ; voir le tableau des matériaux.
   12. Rafraîchissez le milieu ND complet deux fois par semaine jusqu’au jour 28.

Table 1.

Remarque sur la densité de placage de la rosette dissociée : si les fragments de rosette ne semblent pas complètement dissociés, afin d’atteindre une densité de placage cellulaire d’environ 15.000 cellules/cm2, les fragments de rosette dissociés dérivant d’environ 50 EBs/1 x 60mm-boîte peuvent être remis en suspension dans 50 mL de milieu NRI complet et plaqués comme suit (selon le format de la plaque) :

Plaques multipuits / MEA	Aire de croissance (cm2/puits)	Volume de la suspension cellulaire sur plaque par puits (ou puce MEA)	Nombre maximum de plaques pouvant être plaquées (avec 50 ml de suspension cellulaire)
96 puits	0,3	100 UL	5
48 puits	0,7	220 ul	4
24 puits	deux	625 UL	3
12 puits	4	1,25 ml	3
6 puits	10	3,125 ml	deux
Puce MEA à puits unique	3.5	1,1 ml	45

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du protocole de différenciation neuronale. (Partie supérieure) Les colonies IMR90-hiPSC peuvent être coupées en fragments pour former des corps embryoïdes (EB). Après 2 jours in vitro (DIV), les EB peuvent être plaqués sur des boîtes recouvertes de laminine ou de matrice standard et cultivés en présence d’un milieu d’induction neuroépithéliale (NR...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
hiPSC EB moyen :
DMEM KO	Thermo-Fisher	Référence 10829-018	(Étape 2.1.7)
Remplacement du sérum knockout (KOSR)	Thermo-Fisher	Référence 10828-028	Concentration finale de 20 % (étape 2.1.7)
Acides aminés non essentiels	Thermo-Fisher	Référence 11140-035	(Étape 2.1.7)
Pénicilline/streptomycine	Thermo-Fisher	Référence 15140-122	Concentration finale de 50 U/mL (étape 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	Référence 25030-081	Concentration finale de 2 mM (étape 2.1.7)
β-Mercaptoéthanol	Thermo-Fisher	Référence 31350-010	Concentration finale de 50 μM (étape 2.1.7)
Milieu d’induction neuroépithéliale complet (NRI) :
DMEM/F12	Thermo-Fisher	Référence 3133-038	(Étape 2.3.1)
Acides aminés non essentiels	Thermo-Fisher	Référence 11140-035	(Étape 2.3.1)
Supplément N2	Thermo-Fisher	Référence 17502-048	(Étape 2.3.1)
Pénicilline/streptomycine	Thermo-Fisher	Référence 15140-122	Concentration finale de 50 U/mL (étape 2.3.1)
Héparine de grade I-A, ≥180 unités USP/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	Concentration finale de 2 μg/ml (étape 2.3.1)
bFGF	Thermo-Fisher	Référence 13256-029	20 ng/ml de concentration finale ajoutée avant l’utilisation (étape 2.3.1)
Matrigel Matrice de membrane basale	Corning	354234	1:100 (étape 2.2). Décongelez le Matrigel sur de la glace, préparez 200 ul aliquotes et conservez-les à -80°C. Pour l’enrobage, diluer 200 ul d’aliquote dans 20 ml de milieu DMEM/F12 froid.
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (étape 2.2). Diluer dans PBS 1X.
Milieu de différenciation neuronale complet (ND) :
Milieu neurobasal	Thermo-Fisher	21103049	(Étape 2.4.11)
Suppléments de B-27 (50x)	Thermo-Fisher	17504044	(Étape 2.4.11)
Supplément N2	Thermo-Fisher	Référence 17502-048	(Étape 2.4.11)
Pénicilline/streptomycine	Thermo-Fisher	Référence 15140-122	Concentration finale de 50 U/mL (étape 2.4.11)
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	Concentration finale de 1 ng/ml. Ajouté avant utilisation. (Étape 2.4.11)
Le BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	Concentration finale de 2,5 ng/ml. Ajouté avant utilisation. (Étape 2.4.11)