Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissociation des cellules du mésencéphale ventral
- Transférez les morceaux du mésencéphale ventral sous une hotte à flux laminaire. Retirer la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) et ajouter 1 ml d'acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique à 0,05 % préchauffé (37 ºC) (trypsine-EDTA) dans le tube conique (volumes suffisants pour un maximum de 12 morceaux de mésencéphale ventral). Incuber le tissu à 37 ºC pendant 5 à 10 min.
- Retirez la trypsine-EDTA sous le capot et ajoutez 1 ml de milieu de désactivation (le sérum désactivera la trypsine) au tissu.
- Retirez le milieu de désactivation et lavez deux fois le mouchoir dans 1 ml du milieu complet.
note: Pour éviter de jeter les cellules dissociées, évitez de retirer tout le milieu du tube et de pipeter le tissu.
- Ajouter 1 ml de milieu complet et triturer le tissu à l’aide d’une pipette en verre poli au feu. Évitez la formation de bulles et continuez à triturer jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit obtenue.
REMARQUE : Habituellement, 8 à 10 passages à travers l’embout restreint sont nécessaires pour une dissociation complète.
- Centrifugez les cellules à 400 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et retirez le fluide.
- Remettez la pastille en suspension dans 1 ml de milieu complet en pipetant lentement de haut en bas jusqu’à quatre fois.
2. Placage des cellules du mésencéphale ventral
- Mélangez 10 μl de suspension cellulaire avec 90 μl de solution de bleu de trypan et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
note: La viabilité des cellules peut également être vérifiée à ce stade.
- Placez les bouchons de tube de microcentrifugation stérilisés dans des boîtes de Pétri de 100 mm et transférez les lamelles recouvertes de poly-L-ornithine/laminine, à l’aide d’une pince, une à la fois sur les bouchons.
note: Ne lavez pas les lamelles et évitez de sécher la laminine, car cela pourrait provoquer des cultures inégales et diminuer la capacité de survie des cellules.
- Ajustez le volume à 1 500 cellules par 1 μl en ajoutant un milieu complet et 100 μl (total de 150 000 cellules) de suspension de cellule sur chaque lamelle (le volume est optimal pour couvrir la surface de la lamelle sans déversement). Fermez les boîtes de Pétri et incuberez-les pendant 1 heure dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO2).
note: ÉTAPE CRITIQUE : Cette étape est nécessaire pour améliorer l’attachement et la viabilité des cellules et pour augmenter le nombre de lamelles par embryon. Alternativement, les cellules peuvent être transférées directement dans les puits (contenant des lamelles), mais le nombre de cellules doit être porté à 350 000 par puits (au lieu de 150 000). En d’autres termes, en utilisant cette méthode, 8 à 10 lamelles peuvent être acquises, tandis que le transfert direct donne environ 3 à 4 lamelles en raison des cellules qui se fixent aux plaques (à côté ou en dessous des lamelles). La viabilité moyenne des cultures utilisant cette méthode était d’environ 90 %.
3. Croissance et maintien de la culture
- Après 1 heure d’incubation, transférez soigneusement les lamelles, y compris le milieu, dans des plaques à 24 puits contenant 400 μl de milieu complet préchauffé (à 37 ºC) (volume total : 500 μl). Incuber les cellules pendant la nuit (O/N) à 37 ºC.
- Dans les 24 heures suivant l’incubation des puits, ajoutez délicatement 500 μl de milieu complet dans chaque puits.
REMARQUE : Les premières heures sont l’étape la plus critique pour la survie des neurones dopaminergiques, et le nombre de cellules survivantes ne change pas de manière significative au-delà de ce point.
- Ne pas ajouter de substrat supplémentaire aux cultures pendant les deux premières semaines ou jusqu’à ce que le milieu devienne jaune. Si la culture dure plus de deux semaines ou si la couleur du milieu vire au jaune, remplacez la moitié du substrat (500 μl) par un substrat frais et complet préchauffé (généralement toutes les deux semaines).
note: Les neurones dopaminergiques des cultures survivraient plus de six semaines dans ces conditions.
