Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Obtention d’échantillons de tissus
REMARQUE : Un élément critique de ce protocole nécessite une manipulation appropriée du don de tissus dès le moment de l’autopsie. La viabilité globale de l’échantillon dépend en grande partie de la réduction de l’intervalle post-mortem (PMI), du transfert immédiat du tissu dans le milieu froid approprié complété par des antibiotiques et des antimycosiques, du maintien de l’échantillon sur de la glace humide tout au long du transport et du maintien de la technique stérile tout au long du protocole.
- Dès l’annonce d’un don imminent, préparez une trousse de prélèvement d’échantillons. À l’aide d’une boîte d’expédition avec un contenant isotherme qui peut être utilisé directement pour le transport de retour de l’échantillon de tissu, incluez les matériaux suivants :
- Inclure du matériel pour la préparation stérile, y compris des gants stériles, des champs et des scalpels.
- Inclure 8 à 10 tubes coniques stériles de 50 ml contenant 30 ml de milieu d’expédition dans le contenant isotherme avec de la glace ou des compresses froides.
note: Bien que n’importe quel milieu de culture cellulaire standard puisse fonctionner, la meilleure viabilité de l’échantillon est obtenue avec Hibernate-A complété par un antibiotique/antimycosique.
- Inclure d’autres tubes d’échantillonnage pour d’autres analyses (p. ex., fixateurs).
- Si l'autopsie ne sera pas pratiquée sur le site de l'investigateur, incluez un document qui indique clairement comment prélever l'échantillon de tumeur. Cela inclut des détails tels que le maintien de la stérilité, le maintien des tubes d’échantillon sur de la glace humide et l’inclusion d’échantillons du mésencéphale et de la moelle, car les cellules tumorales envahissent souvent ces régions.
- Maintenir la stérilité pendant l’autopsie. Considérez que le cerveau est stérile à l’intérieur du crâne, alors observez la technique stérile (y compris le changement de gants) une fois le crâne ouvert. Il est essentiel d’éviter la contamination par la peau et les cheveux.
- Disséquez la tumeur par la face ventrale (le « ventre » du pont, voir Figure 1). Avec un scalpel stérile, coupez de petits morceaux de 1 cm de la tumeur et transférez-les immédiatement dans un milieu d’expédition froid (voir REMARQUE à l’étape 1.1.2) et mettez de la glace humide. Placez 10 ml de tissu dans chaque tube, ce qui donne un volume final de tissu et de milieu dans chaque tube de 40 ml.
note: Dans le cas du gliome pontique intrinsèque diffus (DIPG), la tumeur s’infiltre de manière diffuse dans le pont et souvent dans le reste du tronc cérébral. Par conséquent, prélevez la plus grande partie possible de l’échantillon, y compris généralement 3 à 4 tubes (30 à 40 ml de tissu) du pont et 1 à 2 tubes (10 à 20 ml de tissu) du mésencéphale et de la moelle épinière.
- Collectez des échantillons du mésencéphale et de la moelle juxtaposés aux ponts, qui contiennent souvent de nombreuses cellules tumorales.
- Après le prélèvement des échantillons, expédiez les échantillons pendant la nuit sur de la glace humide dans le conteneur isotherme. N’expédiez pas l’échantillon sur de la glace sèche, car la congélation tuerait les cellules.
2. Préparation pour le traitement des échantillons
- Avant de commencer la préparation de l’échantillon, stérilisez les capots de culture tissulaire ainsi que les lames de rasoir, les hémostats incurvés et tout autre outil non stérile sous la lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles pour éviter la contamination des cultures.
- Préparez et stérilez des solutions de filtration.
- Pour préparer une solution de saccharose à 1,8 M, dissoudre 308,07 g de saccharose dans 300 mL d’eau distillée. Ajouter 50 ml de solution saline tamponnée 10x Hank's (HBSS) sans calcium ni magnésium et porter le volume total à 500 ml avec de l'eau distillée. Conserver à 4 °C.
- Pour préparer une solution de digestion enzymatique, prendre 50 ml de HBSS avec du calcium et du magnésium pour 10 ml de tissu haché et ajouter 500 μL 5 mg/mL de désoxyribonucléase I (concentration finale 50 μg/mL), 500 μL de 2,5 mg/mL de collagénase I/II et une solution de dispase (concentration finale 25 μg/mL), et 500 μL de tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES). Solution de digestion préchauffée dans un bain-marie à 37 °C.
- Pour préparer la base du milieu de tige tumorale (TSM), mélangez 250 mL de Neurobasal-A, 250 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange nutritif F12 (DMEM/F12), 5 mL d'antibiotique-antimycosique 100x, 5 mL de 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX-A), 5 mL de tampon HEPES, 5 mL de pyruvate de sodium 100 mM et 5 mL d'acides aminés non essentiels 100x MEM.
- Pour préparer une TSM complète avec des facteurs de croissance, ajoutez les suppléments suivants à la base TSM : supplément 50x B27 moins vitamine A (1:50), facteur de croissance épidermique humain (H-EGF, 20 ng/mL), facteur de croissance des fibroblastes humains (H-FGF, 20 ng/mL), facteur de croissance AA DÉRIVÉ DES PLAQUETTES HUMAINES (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), facteur de croissance BB DÉRIVÉ DES PLAQUETTES HUMAINES (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) et solution d’héparine (2 μg/mL).
- Prérefroidir une centrifugeuse de laboratoire équipée d’un rotor à godets oscillants à 4 °C.
3. Dissociation mécanique
- Transférez le tissu dans une boîte de culture cellulaire à paroi haute de 100 mm x 20 mm. Retirer les restes de milieu d’expédition et les remplacer par des milieux de culture froids de 10 à 15 ml.
- À l’aide des hémostats incurvés pour saisir une lame de rasoir, hachez finement le tissu tout en éliminant les vaisseaux sanguins ou les méninges évidents.
note: Les fragments de tissu finaux doivent être inférieurs à 1 mm (voir figure 2B).
- Transférez le mouchoir dans un tube conique propre de 50 ml. Lavez la boîte de culture cellulaire avec 5 ml de milieu de culture froid supplémentaire et transférez-la dans le tube conique. Répétez cette étape de lavage si nécessaire pour transférer le reste du tissu.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, triturer doucement (4 à 5 fois). Laissez les plus gros fragments de tissu se déposer au fond du tube. Si nécessaire, centrifuger brièvement l’échantillon pendant 1 min (350 x g, 4 °C).
- Collectez la fraction dissociée mécaniquement.
- Retirer le surnageant et le filtrer à travers un filtre de 100 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL étiqueté « Dissociation mécanique ». Retourner le filtre sur le tube conique d’origine et laver avec un milieu de culture pour récupérer les fragments de tissu.
- Centrifuger la fraction « Dissociation mécanique » pendant 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retirer le surnageant de la fraction granulée de « dissociation mécanique » et remettre le tissu en suspension dans un milieu de culture froid. S’il y a plus de 5 mL de tissu dans le tube conique de « dissociation mécanique », divisez le tissu en d’autres tubes coniques de 50 mL de sorte qu’aucun tube n’ait plus de 5 mL de tissu.
- Stockez la fraction dissociée mécaniquement sur de la glace jusqu’à l’étape de centrifugation par gradient de saccharose (étape 5). Alternativement, la fraction dissociée mécaniquement peut passer à l’étape 5 pendant la période d’incubation par dissociation enzymatique (étape 4.4).
4. Dissociation enzymatique
- S’il y a plus de 5 ml de tissu dans le tube contenant les fragments de tissu restants plus gros, divisez le tissu en d’autres nouveaux tubes coniques de 50 ml de sorte qu’aucun tube n’ait plus de 5 ml de tissu.
- Centrifuger le(s) tube(s) conique(s) contenant les fragments de tissu restants pendant 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retirer le surnageant et ajouter la solution de digestion enzymatique préchauffée, de sorte qu’il y ait 5 mL de solution de digestion pour 1 mL de tissu (p. ex. 25 mL de solution de digestion pour 5 mL de tissu).
- Scellez les couvercles coniques des tubes avec un film de laboratoire et incubez la réaction sur un rotateur à 37 °C pendant 30 min.
- Après l’incubation, triturez doucement les échantillons (voir figure 2C).
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, piquez l’échantillon de haut en bas 6 à 8 fois. Évitez de générer des bulles d’air excessives.
- Ajoutez une pointe de pipette de 1 000 μL à l’extrémité de la pipette et triturez 6 à 8 fois supplémentaires.
- Laissez les morceaux restants se déposer au fond du tube. Retirez et filtrez le surnageant avec les cellules encore en suspension à travers un filtre de 100 μm dans un nouveau tube conique de 50 ml étiqueté « Dissociation enzymatique » et stockez-le sur de la glace.
- S’il reste des fragments de tissu importants, ajoutez 10 ml de HBSS avec du calcium et du magnésium aux fragments et répétez les étapes 3.5.1 et 3.5.2. Filtrez cette solution finale à travers un filtre de 100 μm dans le tube « Dissociation enzymatique ».
- Centrifuger le tube de « dissociation enzymatique » pendant 5 min (350 x g, 4 °C) et poursuivre la centrifugation par gradient de saccharose.
5. Centrifugation par gradient de saccharose
- Si les échantillons sont encore en suspension dans la solution, centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retirer le surnageant et remettre le tissu en suspension dans 20 mL de HBSS froid sans calcium ni magnésium. Porter le volume jusqu’à 25 mL au total avec HBSS froid.
- Ajouter lentement 25 mL de solution de saccharose 1,8 M et retourner le tube pour mélanger. Il en résulte un gradient de saccharose de 0,9 M.
- Centrifugeuse sans frein pendant 10 min (800 x g, 4 °C). L’utilisation d’un frein de centrifugation perturbera le gradient et réduira le rendement (voir la figure 2D pour un exemple d’échantillon avant et après la centrifugation).
- Aspirez soigneusement les débris de myéline et autant de solution de saccharose que possible. Lavez l’échantillon en ajoutant 30 ml de HBSS froid sans calcium ni magnésium et en mélangeant doucement. Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 °C).
6. Lyse des globules rouges ACK
- Retirez le surnageant de lavage. Ajouter 5 mL de tampon de lyse ACK et remettre doucement la pastille en suspension en faisant tourner le tube pendant 1 min à RT.
- Éteindre la lyse en ajoutant 30 mL de HBSS froid sans calcium ni magnésium.
- Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 °C).
7. Maintenance initiale de la culture
- Remettre en suspension les pastilles cellulaires finales dans 10 à 15 mL de TSM complet chaud avec des facteurs de croissance et quantifier la densité cellulaire viable sur un hémocytomètre à l’aide du bleu de trypan exclusion.
note: La gamme de cellules viables varie considérablement en fonction des circonstances du don de tissus, et la quantification peut être difficile à ce stade précoce en raison des débris cellulaires restants. Dans un cas idéal, visez à avoir un million de cellules vivantes par échantillon. Dans les cas où il reste trop de débris, plaquez à une densité plus faible dans une fiole T175.
- Transférez les suspensions cellulaires finales dans un nouveau flacon de culture T75. Augmentez l’ajout de facteurs de croissance supplémentaires tous les deux jours pour maintenir les niveaux globaux de facteurs de croissance et surveiller le développement des neurosphères des cellules tumorales (voir Figure 2E et Figure 3).
