Différenciation des cellules progénitrices neurales de la moelle épinière en motoneurones

Résumé

Source : Taga, A. et al., Établissement d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une méthode permettant de différencier les cellules progénitrices neurales (NPC) de la moelle épinière en motoneurones. Il détaille le processus de culture des NPC sur une plaque de culture enrobée à l’aide de milieux spécialisés enrichis d’inhibiteurs spécifiques visant à faciliter la différenciation des NPC en motoneurones matures.

Protocole

1. Décongélation des cultures de cellules progénitrices neurales (NPC)

1. Enduire des plaques de 10 cm de polyornithine (PLO) et de laminine la veille de la décongélation des cellules.
   1. Ajouter 5 mL de PLO dilué à 100 μg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou de l’eau distillée (dH₂O) dans des plaques. Incuber à 37 °C pendant au moins 1 h jusqu’à toute la nuit.
   2. Aspirez la solution PLO et rincez les plaques trois fois avec du PBS. (Le PLO est toxique s’il n’est pas correctement lavé.)
   3. Ajouter de la laminine diluée dans du PBS à une concentration de 10 μg/mL sur les plaques revêtues de PLO. Incuber à 37 °C pendant au moins 1 h, de préférence toute la nuit. Après l’incubation, aspirez la solution de laminine sans rinçage pour améliorer l’adhérence cellulaire.
      note: Les plaques peuvent être recouvertes de PLO à l’avance, lavées trois fois à l’eau, séchées dans une hotte stérile et stockées à 4 °C.
2. Décongeler un flacon NPC contenant 6 x 10⁶ cellules/flacon pour chaque plaque de culture cellulaire de 10 cm.
3. Retirez le cryotube NPC de l’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 minutes maximum. Décongelez rapidement en secouant le flacon jusqu’à ce qu’il y ait un petit morceau de glace entouré de liquide.
4. Transférez les agrégats cellulaires dans un tube conique de 15 mL à l'aide d'une pipette de 1000 μL et ajoutez jusqu'à 15 mL de milieu de différenciation neurale (NDM) préchauffé ou de milieu Modified Eagles de Dulbecco (DMEM) / supplément F21 F12 de Ham pour diluer le diméthylsulfoxyde (DMSO).
5. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
6. Aspirez le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire avec le milieu de différenciation des motoneurones (MN) (Tableau 1) + ROCK-I (20 μM), et utilisez une pipette de 1000 μL pour triturer de haut en bas jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire (jusqu’à 5 fois).
7. Transférez la suspension monocellulaire sur une plaque de 10 cm revêtue de PLO-Laminin.
8. Transférez la plaque dans un incubateur et laissez-la tranquille pendant la nuit pour permettre une bonne adhérence cellulaire

2. Différenciation des NPC de la moelle épinière en motoneurones

1. Effectuez les étapes initiales comme mentionné aux étapes 1.1 à 1.8, le milieu final étant le milieu de différenciation MN + ROCK-I (20 μM).
2. Le lendemain du placage, effectuez un remplacement complet du milieu avec le milieu de différenciation MN sans ROCK-I, puis changez le milieu tous les deux jours. Pendant le week-end, nourrissez les cellules le vendredi, puis à nouveau le lundi. Rincez les cellules avec du PBS si nécessaire pour éliminer les débris cellulaires.
3. Changer le milieu avec le milieu de différenciation MN + cytosine arabinoside (ARA-C) (0,02 μM) et incuber pendant 48 h lorsque les progéniteurs gliaux engagés émergent sous forme de cellules plates uniques proliférantes sous des progéniteurs MN post-mitotiques agrégés en grappes de cellules.
   note: Habituellement, cela se produit dans les 7 premiers jours après le placage initial, bien qu’il puisse y avoir une variabilité en fonction de la lignée cellulaire.
4. Après 48 h, aspirer le milieu contenant l’ARA-C, rincer doucement les cultures avec du PBS trois fois et changer le milieu pour du milieu MN frais sans ARA-C.
5. Après le traitement par ARA-C, effectuez des remplacements de milieu tous les deux jours (ou lundi, mercredi et vendredi) en retirant l’ancien milieu avec une pipette manuelle plutôt qu’un aspirateur à vide pour éviter le détachement prématuré des grappes neuronales. De plus, enrichir le milieu MN avec de la laminine 1 μg/mL une fois par semaine pour améliorer encore l’attachement neuronal aux plaques de culture.

Tableau 1 : Milieux de culture

Nom moyen	Réactifs	Concentrations
Milieu de différenciation neuronale (NDM)	Neurobasal L-Glutamine Acides aminés non essentiels Supplément N - N2 Supplément Pénicilline/streptomycine	1x 100x 100x 100x 100x
Milieu de différenciation des motoneurones	Moyen de différenciation neuronale Acide ascorbique Puromorphamine Facteur neurotrophique dérivé du cerveau Facteur neurotrophique ciliaire Facteur de croissance analogue à l’insuline 1 Facteur neurotrophique dérivé d’une lignée cellulaire gliale Acide rétinoïque Composé E Supplément B - Supplément B27	1x 0,4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50x

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture stériles de 10 cm	Faucon	353003
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Thermopêcheur	11140050	Concentration de travail 100x
Supplément N - N2 Supplément	Thermopêcheur	17502048	Concentration de travail 100x
L-Glutamine	Thermopêcheur	Référence 25030	Concentration de travail 100x
Neurobasale	Thermopêcheur	21103049	Concentration de travail 1x
Acide rétinoïque (AR)	sigma	R2625	Dissoudre 100 mg dans 3,3 mL de DMSO pour obtenir 100 mM de solution mère. Aliquote de la matière 100 μL/tube et congélation à -80 ºC. Prenez 200 μL de 100 mM de stock et diluez 10x (ajoutez 1,8 mL de DMSO) pour obtenir 10 mM de stock. Aliquote 50 μL/tube et conserver à -80 ºC. Diluer à 1:10000 pour l’utilisation. (concentration de travail 2 μM).
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	Réf. P3655	Dissoudre 100 mg dans 1 mL de ddW pour obtenir une solution mère de 100 mg/mL. Aliquote de la crosse dans des tubes de 100 μL. (concentration de travail 100 μg/mL)
Laminine	Thermopêcheur	Référence 23017-015	Solution mère 1 mg/mL, concentration de travail 10 μg/mL (enrobage), 1 μg/mL (milieu cellulaire)
Acide ascorbique (ASAC)	sigma	A4403	Dissoudre 100 mg dans 250 mL de dH2O pour obtenir 0,4 mg/ml de stock. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 μm, aliquote et congeler à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 0,4 μg/mL).
Facteur neurotrophique ciliaire (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS stérile, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Composé E	Abcam	AB142164	Dissoudre 250 μg dans 2,0387 mL de DMSO pour obtenir un stock de 250 μM. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer 1:2000 pour l’utilisation. (concentration de travail 125 nM).
DMEM/F12	Thermopêcheur	Référence 113300	Concentration de travail 1x
Neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS à 100 μg/mL, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissoudre 5 mg dans 1480 μL de dH2O pour obtenir 10 mM de bouillon, aliquote et congeler à -80 ºC. Diluer à 1:500 pour l’utilisation. (concentration de travail 20 μM).
Crayonline/Streptomycine	Thermopêcheur	15140122	Concentration de travail 100x
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissoudre 5 mg dans 9,6 mL de DMSO pour obtenir une solution de 1 mM. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer 1:1000 pour l’utilisation. (concentration de travail 1 μM).
Facteur neurotrophique recombinant dérivé du cerveau humain (BDNF)	Peprotech	Référence 450-02	Centrifuger brièvement avant de reconstituer. Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS à 100 μg/mL, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1)	Systèmes de R&D	Référence 291-G1-200	Dissoudre 200 μg dans 2 mL de PBS à 100 μg/mL, puis ajouter 18 mL de BSA-PBS à 0,1 % pour obtenir une quantité de 10 μg/mL et conserver à -80 ºC. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer 10 μg/mL de la substance à 1:1000 pour l’utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS à 100 μg/mL, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Acide rétinoïque (AR)	sigma	R2625	Dissoudre 100 mg dans 3,3 mL de DMSO pour obtenir 100 mM de solution mère. Aliquote de la matière 100 μL/tube et congélation à -80 ºC. Prenez 200 μL de 100 mM de stock et diluez 10x (ajoutez 1,8 mL de DMSO) pour obtenir 10 mM de stock. Aliquote 50 μL/tube et conserver à -80 ºC. Diluer à 1:10000 pour l’utilisation. (concentration de travail 2 μM).
Composé E	Abcam	AB142164	Dissoudre 250 μg dans 2,0387 mL de DMSO pour obtenir un stock de 250 μM. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer 1:2000 pour l’utilisation. (concentration de travail 125 nM).
Supplément B - Supplément B27	Thermopêcheur	21985023	Concentration de travail 50x
Hottes de culture cellulaire stériles	Entreprise Baker	SG-600
Centrifugeuse de culture cellulaire de table	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Bain d’eau	ThermoFisher	Référence 2332	Isotemp
Incubateur de culture cellulaire à humidité contrôlée	ThermoFisher	370	réglé à 37 ºC, 5 % CO2