Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparatifs
- Préparations pour l’isolement du CGNP (progéniteur du neurone granulaire cérébelleux)
- Organiser un accouplement approprié des souris pour générer des animaux P5-P7 afin d’isoler le cervelet (3-5 animaux par ChIP et condition).
- Préparez HBSS/Glucose en ajoutant 6 mg/mL de glucose dans le tampon HBSS.
- Préparez le milieu de culture cellulaire CGNP (CGM) en ajoutant 1 % (v/v) de supplément de N2, 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine-néomycine, 25 mM de KCl et 10 % de FCS au DMEM-F12. Pour la culture CGNP, préparer un milieu CGM sans SCA mais comprenant 0,6 μg/mL SONIC HEDGEHOG (SHH) (CGM-SHH) et l’équilibrer à 37 °C si nécessaire.
- Enduire des plaques de culture cellulaire à 6 puits de 100 μg/mL de poly-D-lysine pendant 1 à 2 h à RT pour l’élimination des cellules gliales. Ensuite, lavez deux fois avec du ddH2O stérile et laissez sécher les plaques. Conservez les plaques pendant une semaine maximum à 4 °C.
- Pour la culture de CGNP, enduire des plaques de culture cellulaire à 6 puits de poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, laver deux fois avec H2O pour la culture cellulaire et laisser sécher les plaques.
note: Les plaques peuvent être stockées pendant une semaine maximum à 4 °C.
- Préparez de la trypsine à 0,025 % (p/v) dans HBSS/Glucose et équilibrez-la à 37 °C si nécessaire.
- Isolement du tissu cérébral par un progéniteur neural
- Isolement et culture facultative de CGNP (progéniteurs de neurones granulaires cérébelleux)
- Euthanasier les animaux P5-7 par décapitation à l’aide de ciseaux. Retirez la peau du cuir chevelu, ouvrez le crâne et retirez le cerveau à l’aide de petits ciseaux et de pinces. Isolez le cervelet et transférez-le dans un HBSS/Glucose glacé. Retirez toutes les méninges et les vaisseaux sanguins et transférez le cervelet dans des tubes de 15 ml remplis de HBSS/Glucose froid.
- Lavez le cervelet trois fois avec 10 mL de HBSS/Glucose glacé (collectez-les par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 °C) et homogénéisez ensuite le cervelet en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette de 1 mL (maximum 2-3 fois) pour obtenir des fragments de0,5 à 1 mm 3.
- Ajouter 5 mL de trypsine à 0,025 % dans HBSS/Glucose et incuber le tissu en remuant constamment dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min. Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de CGM et prélever le tissu par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et triturer le tissu à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL dans 1 mL de CGM et le transférer dans un nouveau tube de 15 mL.
note: Il est important d’éviter les bulles d’air.
- Ajouter 5 mL de CGM et incuber le mélange pendant 2 min sur de la glace pour déposer les restes de tissus. Transvasez le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Ajoutez 2 mL de CGM au tissu résiduel et répétez la procédure de trituration.
- Mettez les surnageants en pool (sans restes de tissus, environ 10 ml au total) et centrifugez à 650 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir les cellules cérébelleuses. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de CGM.
- Étant donné que les astrocytes adhèrent plus rapidement et plus fort à la poly-D-lysine que les CGNP, placez les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes de poly-D-lysine de 100 μg/mL (jusqu’à 4 mL par puits) et incubez pendant 20 min à 37 °C pour éliminer les astrocytes.
- Secouez l’assiette et récupérez le surnageant. Puis centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 °C dans un tube de 15 mL. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de CGM et compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer.
note: Les CGNP sont ronds, petits et présentent un halo lorsqu’ils sont imagés à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
- Si nécessaire, ensemencez les cellules dans du CGM préchauffé à 37 °C sur des plaques recouvertes de poly-L-ornithine (3 x 106 cellules par 6 puits) et incubez-les à 37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative.
note: Le fait de laisser la CGM sur les plaques (et avec ce FBS) entraînera la différenciation des CGNP en neurones granulaires cérébelleux (CGN).
