Isolement et culture de progéniteurs de neurones granulaires cérébelleux murins

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparatifs

1. Préparations pour l’isolement du CGNP (progéniteur du neurone granulaire cérébelleux)
   1. Organiser un accouplement approprié des souris pour générer des animaux P5-P7 afin d’isoler le cervelet (3-5 animaux par ChIP et condition).
   2. Préparez HBSS/Glucose en ajoutant 6 mg/mL de glucose dans le tampon HBSS.
   3. Préparez le milieu de culture cellulaire CGNP (CGM) en ajoutant 1 % (v/v) de supplément de N2, 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine-néomycine, 25 mM de KCl et 10 % de FCS au DMEM-F12. Pour la culture CGNP, préparer un milieu CGM sans SCA mais comprenant 0,6 μg/mL SONIC HEDGEHOG (SHH) (CGM-SHH) et l’équilibrer à 37 °C si nécessaire.
   4. Enduire des plaques de culture cellulaire à 6 puits de 100 μg/mL de poly-D-lysine pendant 1 à 2 h à RT pour l’élimination des cellules gliales. Ensuite, lavez deux fois avec du ddH₂O stérile et laissez sécher les plaques. Conservez les plaques pendant une semaine maximum à 4 °C.
   5. Pour la culture de CGNP, enduire des plaques de culture cellulaire à 6 puits de poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, laver deux fois avec H₂O pour la culture cellulaire et laisser sécher les plaques.
      note: Les plaques peuvent être stockées pendant une semaine maximum à 4 °C.
   6. Préparez de la trypsine à 0,025 % (p/v) dans HBSS/Glucose et équilibrez-la à 37 °C si nécessaire.
2. Isolement du tissu cérébral par un progéniteur neural
   1. Isolement et culture facultative de CGNP (progéniteurs de neurones granulaires cérébelleux)
      1. Euthanasier les animaux P5-7 par décapitation à l’aide de ciseaux. Retirez la peau du cuir chevelu, ouvrez le crâne et retirez le cerveau à l’aide de petits ciseaux et de pinces. Isolez le cervelet et transférez-le dans un HBSS/Glucose glacé. Retirez toutes les méninges et les vaisseaux sanguins et transférez le cervelet dans des tubes de 15 ml remplis de HBSS/Glucose froid.
      2. Lavez le cervelet trois fois avec 10 mL de HBSS/Glucose glacé (collectez-les par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 °C) et homogénéisez ensuite le cervelet en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette de 1 mL (maximum 2-3 fois) pour obtenir des fragments de^0,5 à 1 mm 3.
      3. Ajouter 5 mL de trypsine à 0,025 % dans HBSS/Glucose et incuber le tissu en remuant constamment dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min. Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de CGM et prélever le tissu par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
      4. Retirer le surnageant et triturer le tissu à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL dans 1 mL de CGM et le transférer dans un nouveau tube de 15 mL.
         note: Il est important d’éviter les bulles d’air.
         1. Ajouter 5 mL de CGM et incuber le mélange pendant 2 min sur de la glace pour déposer les restes de tissus. Transvasez le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Ajoutez 2 mL de CGM au tissu résiduel et répétez la procédure de trituration.
      5. Mettez les surnageants en pool (sans restes de tissus, environ 10 ml au total) et centrifugez à 650 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir les cellules cérébelleuses. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de CGM.
      6. Étant donné que les astrocytes adhèrent plus rapidement et plus fort à la poly-D-lysine que les CGNP, placez les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes de poly-D-lysine de 100 μg/mL (jusqu’à 4 mL par puits) et incubez pendant 20 min à 37 °C pour éliminer les astrocytes.
      7. Secouez l’assiette et récupérez le surnageant. Puis centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 °C dans un tube de 15 mL. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de CGM et compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer.
         note: Les CGNP sont ronds, petits et présentent un halo lorsqu’ils sont imagés à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
      8. Si nécessaire, ensemencez les cellules dans du CGM préchauffé à 37 °C sur des plaques recouvertes de poly-L-ornithine (3 x 10⁶ cellules par 6 puits) et incubez-les à 37 °C, 5 % de CO₂ et 100 % d’humidité relative.
         note: Le fait de laisser la CGM sur les plaques (et avec ce FBS) entraînera la différenciation des CGNP en neurones granulaires cérébelleux (CGN).