1. Génération d’organoïdes cérébraux corticaux (Figure 1)
REMARQUE : Toutes les étapes de cette section du protocole se dérouleront dans une cagoule de biosécurité de classe 2, sauf indication contraire.
- Induction de colonies neuroectodermiques 2D à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) Culture 2D (Jours -1 à 3)
- Avant l’induction, placez les colonies de hPSC sur une matrice de membrane basale qualifiée de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) dans une plaque à 6 puits à une densité de 20 à 30 %. Atteignez cette densité en faisant passer les colonies de hPSC d’un puits d’une plaque de 6 puits à 60 % de confluence dans trois puits d’une plaque de 6 puits.
- Pour le revêtement de la matrice de la membrane basale, diluez la matrice de la membrane basale dans un rapport de 1:50 dans un milieu basal ordinaire. Déposez uniformément 1 ml/puits d’une plaque à 6 puits, incubez pendant 1 heure à température ambiante, puis aspirez.
- Maintenir les colonies de hPSC pendant 1 jour dans 2 mL d’un milieu de culture cellulaire exempt de sérum avant la différenciation.
- Le jour de la différenciation des hPSC, inspectez les colonies de hPSC à l’aide de la microscopie à fond clair à un grossissement de 4x à 10x pour garantir des colonies saines sans différenciation détectable.
note: Les hPSC sains formeront des colonies à bords serrés avec des cellules qui ont un gros noyau, un très petit cytoplasme et des nucléoles proéminents. Les colonies d’iPSC différenciées présenteront des différences morphologiques claires par rapport à celles des colonies d’hPSC décrites ci-dessus, en particulier autour des bords extérieurs des colonies ou au centre.
- Ajouter les réactifs énumérés dans le tableau 1 pour constituer le milieu N2 nécessaire à la différenciation. Amenez ce support à RT avant utilisation.
- Une fois à l’AT, aspirer le milieu de culture cellulaire exempt de sérum de chaque puits de la plaque à 6 puits et le remplacer par 2 mL de milieu N2 délicatement ajouté à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
- Ajouter le double suppresseur des mères contre les inhibiteurs décapentaplégiques (SMAD), le SB-431542 (10 μM) et le 193189 LDN (100 nM).
note: Les inhibiteurs de SMAD peuvent être ajoutés au milieu N2 après que le milieu a été placé dans chaque puits ou à la quantité requise de milieu N2 avant de remplacer le milieu de culture cellulaire sans sérum. Les inhibiteurs peuvent être incorporés uniformément dans le milieu en faisant tourner doucement la plaque ou en inversant le tube contenant le milieu et les inhibiteurs 3 à 4 fois.
- Ajouter quotidiennement dans chaque puits un milieu N2 frais complété par du SB-431542 (10 μM) et du 193189 LDN (100 nM) pendant les 2 prochains jours.
note: Un milieu N2 frais est ajouté pour réduire l’exposition prolongée des cellules au diméthylsulfoxyde (DMSO) utilisé pour dissoudre les composés 193189 SB-431542 et LDN et prévenir la cytotoxicité.
- Génération de sphéroïdes neuroectodermiques 3D à partir de colonies neuroectodermiques 2D induites (jours 3 à 7)
- Liftez les colonies neuroectodermiques induites à l’aide de la dispase en suivant les étapes 1.2.2-1.2.8.
- Tout d’abord, retirez 2 ml de milieu N2 de la plaque à 6 puits et lavez-en 1 fois avec du HBSS pour vous assurer que tout le milieu N2 est éliminé.
note: Le milieu N2 peut interférer avec l’activité enzymatique de la dispase, empêchant le détachement adéquat des colonies neuroectodermiques du puits.
- Ajouter 1 mL de dispase de 2,4 unités/mL dans chaque puits contenant la colonie.
- Incuber le puits pendant 20-25 min (maximum 30 min) à 37 °C. Vérifiez régulièrement qu’il n’y a pas de détachement de la colonie.
note: Les petites colonies peuvent se détacher en 20 minutes. Toutes les colonies qui restent bloquées après 30 minutes doivent être ignorées.
- Après l’incubation, ajoutez 1 mL de milieu N2 dans le puits pour arrêter l’activité de l’enzyme dispase et transférez les colonies dans un tube de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large calibre ou d’une pointe de pipette P1000 modifiée coupée avec des ciseaux stériles (ce qui en fait une pointe P1000 à large calibre).
- Laissez les touffes de la colonie couler au fond du tube par gravité.
note: Ce processus prendra environ 1 minute.
- Une fois que les amas ont coulé, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette P1000 standard et remplacez-le par 1 ml de milieu N2 frais. Répétez cette étape de lavage trois fois pour assurer l’élimination complète de dispase.
note: Toute dispase restante empêchera une formation uniforme de sphéroïdes neuroectodermiques et induira la mort cellulaire.
- Après le lavage, remettre en suspension les amas cellulaires dans 3 mL de milieu N2, transférer dans un puits d’une plaque à 6 puits et ajouter 40 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF).
note: Si un grand nombre de colonies neuroectodermiques étaient détachées, ces colonies pourraient être plaquées sur deux puits ou plus d’une plaque à 6 puits pour empêcher la fusion des sphéroïdes. 24 h après le détachement dispase des colonies, vérifier si les sphéroïdes se sont formés.
- Maintenez les sphéroïdes dans le même milieu pendant les 3-4 prochains jours, mais ajoutez quotidiennement du bFGF frais (40 ng/mL) dans chaque puits pour favoriser la prolifération des cellules neuroectodermiques, l’auto-organisation, et induire et développer les neuroépithéliums.
note: Si les sphéroïdes ont été plaqués à une densité plus élevée, le milieu risque de jaunir et de devoir être remplacé tous les 2 jours par du bFGF frais (40 ng/mL). Cependant, ce n’est pas recommandé, et au lieu de cela, un nombre inférieur de sphéroïdes doit être maintenu dans chaque puits pour éviter ce problème. Les sphéroïdes peuvent être incrustés dans la matrice de la membrane basale après 3 jours si les neuroépithéliums sont évidents. Si les neuroépithéliums ne sont pas évidents ou n’ont pas l’air forts, conservez les sphéroïdes pour un autre jour et vérifiez à nouveau.
Tableau 1 : N2 Moyen. Le tableau répertorie les réactifs nécessaires à la préparation du milieu N2.
| Composants multimédias | concentration |
| DMEM Mélange nutritif F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| Supplément N2 5 mL (100x) | Supplémenté à 1 % |
| B 27 Supplément 10 mL | Supplémenté à 2 % |
| Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x) | Supplémenté à 1 % |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Supplémenté à 1 % |
| 2-Mercaptoéthanol 50 mL(1000x ) | Supplémenté à 0,1 % |
