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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du matériel de dissection, des milieux de culture, des dispositifs microfluidiques
- Autoclave Pinces et ciseaux de micro-dissection (121 °C, temps de stérilisation : 20 min) et conservez-les dans un récipient stérile.
- Stérilisez les lamelles en verre (24 mm x 24 mm) en les incubant dans 1 M de HCl pendant 24 heures sur un agitateur orbital à 37 °C. Lavez-les trois fois avec du H2O stérile distillé et trois fois avec de l’éthanol à 99 %. Séchez ensuite les lamelles à 37 °C ou sous une hotte à écoulement stérile. Enfin, autoclavez ou exposez les lamelles à la lumière UV (30 min) pour terminer la stérilisation. Les lamelles peuvent ensuite être stockées dans de l’éthanol à 70
%.
- À l’aide d’une pince stérile, retirez délicatement les dispositifs d’isolation AXIS Axon de l’emballage et placez-les dans une boîte de Pétri stérile.
- À l’aide d’un poinçon de biopsie stérile (ø : 1 mm), créez un trou par échantillon à cultiver (Figure 1) en correspondance avec les chambres de culture.
note: Ne percez pas trop près des micro-rainures, car elles pourraient être endommagées par la pression appliquée.
- Stérilisez les dispositifs d’isolement axonale AXIS en les immergeant dans de l’éthanol à 70 %. Ensuite, séchez complètement les dispositifs d’isolation AXIS Axon et les lamelles sous une hotte d’écoulement stérile. Attendez au moins 3 heures avant de continuer.
note: Un séchage incomplet entraînera un assemblage défectueux des dispositifs microfluidiques.
- Placez chaque lamelle dans une boîte de Pétri de 35 mm ou un puits dans une plaque à 6 puits.
- Placez le dispositif d’isolation AXIS Axon sur la lamelle et appuyez doucement mais fermement avec une pince aux extrémités pliées pour permettre une adhérence complète entre le dispositif d’isolation et la lamelle en verre.
- Dans chaque chambre de culture, pipeter 150 μl de poly-D-lysine (0,1 mg/ml dans du H2O stérile distillé). Placez les dispositifs microfluidiques sous vide pendant 5 min, afin d’évacuer tout l’air des chambres de culture.
- Si l’air est encore visible à l’intérieur des chambres, pipetez à nouveau la solution de poly-D-lysine dans les chambres.
- Incuber les appareils avec de la poly-D-lysine O/N à 37 °C.
- Laver les chambres trois fois avec du H2O distillé stérile.
- Remplissez les chambres avec une solution de travail de laminine de 150 μl (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un milieu sans sérum) et incubez O/N à 37 °C.
- Préparez 50 ml de milieu pour les cultures de ganglions du trijumeau avec la composition suivante : 48 ml de milieu neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 5 ng/ml de facteur de croissance nerveuse (NGF), 0,25 pM de cytosine arabinoside.
- Préparez 50 ml de milieu pour les cultures de germes dentaires avec la composition suivante : 40 ml de milieu modifié Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 ml de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale : 20 %), 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 150 μg/ml d'acide ascorbique.
2. Génération et dissection d’embryons de souris
- Déterminer l’âge embryonnaire à partir du plug vaginal (plug vaginal : jour de développement embryonnaire 0,5, E0,5) et le confirmer par des critères morphologiques. Pour ce protocole, nous utilisons généralement des embryons de souris E14.5-E17.5.
- Nettoyez la zone de dissection et le stéréoscope avec de l’éthanol à 70 %.
- Sacrifier la mère enceinte par luxation cervicale. Positionnez le cou de la souris entre le premier et le deuxième doigt sur une grille et tirez de manière décisive sur la queue.
- Disséquez la peau autour du bas-ventre et ouvrez l’abdomen à l’aide de ciseaux. Localiser l’utérus : pendant les derniers stades de la grossesse, l’utérus remplit abondamment la cavité abdominale.
- Disséquez l’utérus et placez-le dans un tube rempli de PBS sur de la glace. Lorsqu’il est sur de la glace, le tissu peut être laissé pendant plusieurs heures. Jetez le cadavre de la mère conformément aux directives institutionnelles.
- Disséquez les embryons de l’utérus et libérez-les de leurs tissus extra-embryonnaires. Placez les embryons dans PBS sur de la glace.
- Décapitez les embryons à l’aide de ciseaux et séparez la mâchoire inférieure du reste de la tête à l’aide de ciseaux de micro-dissection (figure 2A). Retirer la mâchoire inférieure avec précision, sans endommager les ganglions du trijumeau ; Comme ces derniers sont localisés à proximité de la mâchoire inférieure, des dommages accidentels sont possibles. Conservez la mâchoire inférieure et le reste de la tête dans du PBS froid, sur de la glace.
- Pour disséquer les ganglions du trijumeau (TG), prenez la tête et placez-la sur une boîte de Pétri en verre de dissection, préalablement remplie de PBS froid. À l’aide de la pince, retirez la peau et le crâne. Retirez ensuite le télencéphale et le cervelet en plaçant une pince sous le télencéphale et soulevez-le ; Le télencéphale et le cervelet se retourneront ensemble, laissant le bas du crâne exposé.
- Localiser les ganglions du trijumeau (Figure 2B). Utilisez une pince pour séparer le TG des nerfs trijumeau. Éliminez les restes des projections du trijumeau en utilisant les aiguilles de dissection comme couteaux. Placez le TG disséqué dans une boîte de Pétri remplie de PBS froid et conservez-les sur de la glace.
- Pour disséquer des dents embryonnaires, placez la mâchoire inférieure, préalablement séparée du crâne, sur la boîte de Pétri en verre de dissection, remplie de PBS froid. À l’aide d’aiguilles de dissection comme couteaux, retirez la langue et la peau entourant la mâchoire. Séparez les hémi-mâchoires gauche et droite en coupant le long de la ligne médiane de la mâchoire. Les germes dentaires sont facilement visibles, comme le montre la figure 2C. Isolez les germes dentaires à l’aide d’aiguilles de dissection et retirez l’excès de tissus non dentaires. Placez les germes dentaires disséqués dans une boîte de Pétri remplie de PBS froid et conservez-les sur de la glace.
3. Co-cultures microfluidiques
- Après la dissection, retirez la laminine des dispositifs microfluidiques. Remplissez les chambres avec 200 μl du fluide correspondant.
- À l’aide d’une pince, transférez doucement le TG disséqué et les germes dentaires dans les trous créés par poinçonnage (Figure 2D). Assurez-vous que les germes dentaires ne flottent pas et qu’ils coulent jusqu’à ce qu’ils entrent en contact avec les lamelles.
- Cultivez les échantillons dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
- Changer le milieu de culture toutes les 48 heures. Ne videz pas complètement les chambres et ne pipetez pas directement dans les chambres de culture.
La vidange complète des chambres entraînerait la formation de bulles d’air à l’intérieur des chambres ; Un pipetage direct dans la chambre entraînerait des lésions axonales. Pour éviter ces problèmes, retirez le fluide en pointant la pipette vers le côté externe des puits ; De même, pipetez le milieu frais sur le côté des puits situés en face des chambres.
- Les co-cultures peuvent être facilement imagées par microscopie time-lapse pendant la période de culture et peuvent être maintenues pendant plus de 10 jours.
- Après la période de culture, lavez les chambres en pipetant 150 μl de PBS dans un puits par chambre, et en laissant le PBS s’écouler trois fois à travers les chambres.
- Retirer le PBS et fixer les échantillons en pipetant 150 μl de paraformaldéhyde à 4 % (dans du PBS) dans un puits par chambre ; incuber à RT pendant 15 min. Laver les chambres deux fois avec du PBS comme décrit au point 3.6.
- Poursuivez avec une analyse plus approfondie.
