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REMARQUE : La figure 1A, B montre un schéma de la puce de copolymère d’oléfine cyclique (COC) préassemblée, y compris l’emplacement des canaux ou compartiments principaux, des puits et des microsillons. La puce compartimentée peut établir des microenvironnements fluidiques distincts à l’intérieur d’un compartiment, comme le démontre l’isolement du colorant alimentaire (Figure 1C).
1. Revêtement de puces à compartiments multiples pour neurones hSC
REMARQUE : La figure 2A montre une vue d’ensemble des procédures de revêtement.
- Dissoudre la poly-L-ornithine dans de l’eau distillée de culture cellulaire pour obtenir 600 μL de solution par puce d’une solution de travail de 20 μg/mL.
- Aspirez le reste de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) restante après la préparation des copeaux des puits. Lors de l’aspiration, assurez-vous que la pointe de la pipette est éloignée de l’ouverture du canal.
note: Les canaux microfluidiques doivent rester remplis pendant toute la durée de cette procédure. N’aspirez pas de liquide des canaux/compartiments, seulement des puits.
- Chargez 150 μL de solution de travail de poly-L-ornithine dans le puits supérieur droit. Attendez 90 secondes ou jusqu’à ce que le liquide commence à remplir le puits inférieur droit. Ajoutez 150 μL de fluide dans le puits inférieur droit et attendez 5 min pour laisser passer le liquide à travers les microsillons.
- Ajoutez 150 μL de média dans le puits supérieur gauche. Attendez 90 s, puis ajoutez 150 μL dans le puits inférieur gauche. Enveloppez le support de la ou des puces avec du parafilm et placez-le à 4 °C pendant la nuit.
note: Vous pouvez également placer la puce et le support à 37 °C pendant 1 h.
- Aspirez le fluide des puits, en veillant à ce que la pointe de la pipette soit placée loin de l’ouverture du canal. Ajouter 150 μL d’eau stérile dans le puits supérieur droit. Attendez 90 s, puis ajoutez 150 μL dans le puits inférieur droit. Attendez 5 min pour laisser passer le liquide à travers les micro-rainures.
- Ajoutez 150 μL d’eau stérile dans le puits supérieur gauche, attendez 90 s, puis ajoutez 150 μL supplémentaires dans le puits inférieur gauche.
- Répétez les étapes 1.5-1.6.
- Décongeler lentement la laminine à une température de 2 °C à 8 °C et préparer une solution de travail de 10 μg/mL.
- Chargez 150 μL de la solution de travail de la laminine dans le puits supérieur droit. Attendez 90 secondes ou jusqu’à ce que le liquide commence à remplir le puits inférieur droit. Pipette de 150 μL vers le puits inférieur droit. Attendez 5 min pour laisser passer la laminine à travers les micro-rainures.
- Ajoutez 150 μL de laminine dans le puits supérieur gauche. Attendez 90 s, puis ajoutez 150 μL dans le puits inférieur gauche. Incuber la puce dans son support pendant 2 h à 37 °C.
- Rincez la puce avec du PBS (sans Ca2+ et Mg2+). Chargez 150 μL de PBS dans le puits supérieur droit. Attendez 90 secondes ou jusqu’à ce que le liquide commence à remplir le puits inférieur droit. Ajoutez 150 μL de PBS dans le puits inférieur droit et attendez 5 min pour laisser le PBS passer à travers les micro-rainures.
- Pipette de 150 μL de PBS vers le puits supérieur gauche. Après 90 s, pipeter 150 μL vers le puits inférieur gauche.
- Aspirez le PBS de la puce, puis rincez-la avec un support NSC (voir le tableau des matériaux). Chargez 150 μL de fluide dans le puits supérieur droit. Après 90 s ou lorsque le liquide passe par le canal droit dans le puits inférieur droit, ajoutez 150 μL dans le puits inférieur droit. Attendez 5 minutes pour laisser le média s’écouler à travers les microsillons.
- Ajoutez 150 μL de média dans le puits supérieur gauche et 150 μL supplémentaires dans le puits inférieur gauche. Incuber la puce dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pour préconditionner la puce jusqu’à ce qu’elle soit prête à ensemencer les CSN.
note: Les puces peuvent être préconditionnées pendant la nuit si nécessaire.
2. Amorçage des NSC dans la puce multicompartiment
REMARQUE : Ce protocole a utilisé des NSC achetés dans le commerce, contrairement à notre publication précédente qui avait commencé avec des cellules souches embryonnaires humaines. Dans ce protocole, les cellules souches neurales sont plaquées directement dans les puces en plastique où elles se différencient en neurones. On peut laisser les cellules proliférer sous forme de CSN (sans différenciation) pendant un maximum de 2 passages et être stockées dans des flacons dans du liquideN2 pour une utilisation ultérieure. Ce protocole utilise des flacons de CSN stockés dans le liquide N2 après le passage 1 ou 2. La figure 2B montre une vue d’ensemble des procédures d’enrobage.
- Décongeler les NSC selon les instructions du fabricant.
note: Cette procédure s’applique aux NSC dérivées de H9. D’autres lignées cellulaires nécessiteront une optimisation de la densité cellulaire.
- Comptez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez à l’aide d’un milieu NSC pour obtenir une concentration de 7 x 106 cellules par ml.
- Aspirez le support de chaque puits de la puce. Évitez d’aspirer des fluides à partir des canaux principaux.
- Pipetez 5 μL de la solution cellulaire dans le puits supérieur droit, puis 5 μL dans le puits inférieur droit (70 000 cellules au total). Assurez-vous que les cellules sont pipetées vers les ouvertures du canal principal. À l’aide d’un microscope, vérifiez que les cellules ont pénétré dans le canal. Attendez 5 min que les cellules adhèrent au bas de la puce.
note: L’un ou les deux compartiments peuvent être utilisés pour charger les cellules.
- Pipetez ~150 μL de média NSC vers le puits supérieur droit, puis 150 μL vers le puits inférieur droit. Répétez l’opération sur le côté gauche. Incuber à 5 % de CO2, 37 °C dans un récipient humidifié approprié.
- Après 48 heures, aspirez le milieu NSC des puits et remplacez-le par un milieu de différenciation neurale en ajoutant 150 μL à chaque puits supérieur et à chaque puits inférieur.
- Cultivez les neurones dans un incubateur à 5 % de CO2, à 37 °C dans un récipient humidifié approprié.
