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1. Préparation des solutions
- Préparez une solution de dissociation tissulaire à base de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) contenant du rouge de phénol stérile avec de la papaïne (100 U/ml), de la cystéine (0,2 mg/ml) et de la désoxyribonucléase (DNase, 250 U/ml).
- Pour préparer la solution de DNase, diluez 100 mg de poudre lyophilisée de DNase I (un flacon) dans 50 mL de H2O. Mélangez bien et filtrez la solution mère. Préparez 10 mL d’aliquotes de bouillon. Divisez un tube de bouillon en aliquotes à usage unique de 0,5 ml. Conservez ces aliquotes à usage unique à -80 °C.
- Préparez les réactifs de séparation magnétique en préparant le tampon de colonne magnétique X : une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % et une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 2 mM.
- Pour préparer un milieu neurofloral, utilisez un milieu neurobasal contenant de la pénicilline/streptomycine avec de la L-glutamine et un supplément de 2 % de B27, de 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique recombinant humain (EGF) et de 20 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques recombinants humains (bFGF).
- Pour préparer le milieu de différenciation, utilisez un milieu neurobasal et complétez avec 10 ng/mL de facteur différencié de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA) ou 10 ng/mL de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) et 2 % de B27.
- Utilisez des plaques de culture à 12 puits (3,5 cm2) et 6 puits (9,6 cm2).
2. Dissection du cervelet
- Anesthésier les petits souris (P3-P7) avec de l’isoflurane et décapiter à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Vaporisez les têtes séparées des chiots avec de l’éthanol à 70 %.
- Transférez chaque tête dans une boîte de culture stérile vide de 10 cm. Séparez la peau à l’aide de ciseaux de microdissection, puis retirez le crâne en passant les ciseaux sagittaux le long de la ligne médiane.
- À l’aide de la pince #7, décollez les os du crâne en commençant par la caudale à partir du tronc cérébral. Soulevez délicatement le cerveau à l'aide d'une spatule, en gardant le cervelet intact, et transférez le cerveau dans une boîte fraîche et stérile de 10,0 cm contenant 15 ml de solution de solution de sel équilibré de Hanks (HBSS) glacée.
- Placez la parabole contenant le cerveau sous un microscope de dissection. À l’aide d’une pince fine #5, retirez les méninges et les gros vaisseaux sanguins du cervelet et séparez le cervelet du tronc cérébral à l’aide de la spatule.
- Transférez le cervelet dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5,0 mL de solution HBSS glacée. Lavez le cervelet en rinçant et en transvasant 3,0 fois avec 5,0 mL de HBSS.
note: Chaque cervelet doit être placé dans son propre tube pour un traitement ultérieur.
3. Préparation de la suspension cellulaire
- Placez la parabole contenant le cerveau sous un microscope de dissection. À l’aide d’une pince fine #5, retirez les méninges et les gros vaisseaux sanguins du cervelet et séparez le cervelet du tronc cérébral à l’aide de la spatule.
- Transférez le cervelet dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5,0 mL de solution HBSS glacée. Lavez le cervelet en rinçant et en transvasant 3,0 fois avec 5,0 mL de HBSS.
note: Chaque cervelet doit être placé dans son propre tube pour un traitement ultérieur.
- Après le dernier rinçage, ajoutez 5 ml de solution de dissociation tissulaire à base de papaïne qui a été préchauffée à 37 °C. Incuber le tissu pendant 15 min à 37 °C dans un bain-marie. Mélangez lentement le contenu en inversant le tube de haut en bas 3 à 5 fois toutes les 3 minutes, à l’aide d’un mélangeur à noix ou à la main.
- Préparez une pipette Pasteur de grand diamètre (pipette en verre ordinaire) et de diamètre étroit (polie au feu en chauffant sur un bec Bunsen) comme décrit précédemment.
- Lavez le mouchoir 3 fois avec 5 mL de solution HBSS, en évitant de perdre le mouchoir lors de la décantation à la main.
- Retirer le dernier lavage HBSS et ajouter 5 mL de solution DPBS contenant 250 μL de solution de DNase dans le tissu. Dissociez le tissu en triturant 10x–15x à l’aide de la pipette Pasteur de grand diamètre. Effectuez cette étape en douceur pour éviter la formation de bulles.
- Ensuite, incubez le lisier pendant 10 minutes supplémentaires à 37 °C dans le bain-marie, en mélangeant en inversant et en redressant le tube.
- Utilisez la pipette Pasteur de diamètre réduit pour triturer davantage la boue tissulaire 10x. S’il reste de gros morceaux de tissu, appuyez doucement les morceaux de tissu contre le fond du tube avec la pointe de la pipette et continuez à pipeter jusqu’à ce que les cellules atteignent une suspension fine.
- Incuber le tissu à 37 °C pendant 10 minutes supplémentaires, en répétant les étapes de mélange précédentes.
4. Immunomarquage des cellules souches
- Placez les tubes à centrifuger sur de la glace et utilisez des solutions glacées pour les étapes suivantes. Filtrez les cellules dissociées à travers une crépine de 40 μm dans un tube à centrifuger de 50 mL. Complétez le filtre avec 10,0 mL de solution HBSS pour vous assurer que les cellules passent à travers le maillage dans cette solution supplémentaire.
- Transférez les cellules filtrées dans un tube à centrifuger frais de 15 ml et centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirez et éliminez complètement le surnageant à l’aide d’un aspirateur à vide.
- Remettre la pastille en suspension dans 160 μL de tampon à colonne magnétique. Pour obtenir la suspension unicellulaire avant le marquage magnétique, faites passer les cellules à travers un treillis en nylon de 30 μm pour éliminer les amas de cellules, qui peuvent autrement obstruer la colonne.
- Ajoutez 40 μL de microbilles d’anti-prominine-1 dans chaque tube de 15 ml, mélangez et incubez au réfrigérateur pendant 15 minutes afin que l’anticorps se lie aux cellules exprimant la prominine-1.
- Laver les cellules en ajoutant 1,0 à 2,0 mL de tampon de colonne X et centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Aspirer complètement le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 1,0 mL de tampon de colonne X.
note: Si de petits amas sont observés après la remise en suspension de la pastille avec 1,0 mL de tampon de colonne X, ils doivent être éliminés avec précaution à l’aide de l’extrémité de la pipette Pasteur, sinon ces amas peuvent bloquer la colonne magnétique lors du tri des cellules.
5. Préparation de la colonne magnétique, tri des cellules et placage
REMARQUE : La séparation magnétique des différentes conditions de génotype (maladie vs contrôle) doit être effectuée en même temps, car tout retard peut affecter la morphologie de la neurosphère.
- Préparez les colonnes magnétiques en les plaçant sur le support magnétique exposé au champ magnétique. Rincez une fois la colonne avec 500 μL de tampon X en appliquant un tampon qui s’égoutte dans un tube à centrifuger pour être jeté.
note: Préparez un nouveau tampon de colonne magnétique X pour chaque expérience ; Si ce n’est pas le cas, le rendement en cellules souches sera faible.
- Appliquez la suspension de cellule étiquetée sur la colonne. Prélever le flux contenant des cellules non marquées qui sont principalement constituées de cellules mixtes neuronales/gliales cérébelleuses dans des tubes frais de 15 mL (figure 1A).
- Laver la colonne 3 fois avec 500 μL de tampon X (chaque lavage dure environ 2 à 4 min).
note: La culture mixte neuronale/gliale cérébelleuse enrichie de neurones granulaires cérébelleux peut servir de sous-produit utile de cette étape de purification.
- Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la dans un tube de 1,5 ml. Ajoutez 1,0 mL de milieu de culture (milieu de neurosphère) dans la colonne et enfoncez le piston dans la colonne pour rincer les cellules marquées avec des billes de prominin-1 dans un tube de faucon frais de 1,5 mL.
- Pour améliorer la pureté des cellules marquées à la prominine-1, passez les cellules éluées sur une deuxième colonne en suivant les étapes 5.1 à 5.4.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Le rendement typique est de 10à 7 cellules par cervelet. Plaquez les cellules sur des plaques de fixation à très faible taux (6 ou 12 puits, en fonction de la densité requise pour les expériences en aval).
6. Passage des neurosphères et différenciation
- Plaquez les cellules souches marquées à la prominine-1 sur des plaques à 12 puits à très faible fixation dans un milieu neurosphérique (5 000 cellules/puits).
- Après 7 à 10 jours, les cellules se divisent pour produire des neurosphères flottantes en forme de boule (neurosphères primaires).
note: Dans cette expérience, des neurosphères secondaires qui se développent en nombre sont générées pour une utilisation ultérieure. Les populations primaires de la neurosphère ne sont pas utilisées pour ces expériences, car elles peuvent contenir des cellules contaminantes qui n’ont pas de propriétés de cellules souches et peuvent s’agglutiner avec les neurosphères.
- Pour le passage, transférez les neurosphères primaires avec le milieu de culture à l’aide des pointes de pipette de 1,0 ml dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Granuler les neurosphères par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de dissociation tissulaire contenant de la papaïne ou une solution de trypsine à 0,05 %. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu neurosphérique et dissocier les cellules mécaniquement à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et en pipetant lentement de haut en bas 10x.
- Plaquez les cellules (à nouveau) dans un milieu de neurosphère comme décrit précédemment. Après 7 à 10 jours de culture, la plaque doit être enrichie de neurosphères secondaires.
note: Ces cultures peuvent être traversées jusqu’à 8x avec une bonne efficacité, après quoi la taille de la neurosphère a tendance à être plus petite et suggère une diminution de la prolifération.
- Comptez les cellules sur l’hémocytomètre et plaquez le nombre optimal pour les expériences futures sur des plaques recouvertes de poly-D-lysine (6 ou 12 puits).
- Pour différencier les cellules souches, prélever les neurosphères du deuxième au huitième passage par centrifugation comme décrit précédemment, sauf ajouter un milieu de différenciation à la cuillette.
note: Après 7 jours in vitro, les cellules souches se différencient en neurones, astrocytes et oligodendrocytes, comme le démontre la coloration avec le marqueur neuronal β-III tubuline, le marqueur astrocytaire Glial fibrillary acidic protein (GFAP) et le marqueur oligodendrocytaire O4.
