Coculture des neurones ganglionnaires rétiniens avec glie engainante olfactive

Résumé

Source : Portela-Lomba, M., et al. Coculture de neurones ganglionnaires rétiniens de rat axotomisés avec des glandes olfactives, en tant que modèle in vitro de régénération axonale adulte. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la procédure permettant d'isoler les neurones ganglionnaires rétiniens (RGN) de la rétine d'un rat et de les co-cultiver avec des cellules gliales olfactives engainantes (OEG). Cette méthode permet d’étudier le potentiel neuro-régénératif des OEG après une lésion neuronale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de l’ihOEG (Ts12 et Ts14) pour le dosage

REMARQUE : Cette étape doit être effectuée 24 h avant la dissection RGN et la coculture.

1. Traiter les lamelles de recouvrement de 12 mm de diamètre avec 10 μg/mL de poly-L-lysine (PLL) pour 1 h
   note: Les lamelles peuvent être laissées toute la nuit dans la solution PLL.
2. Lavez trois fois les lamelles avec 1 tampon de phosphate salin (PBS).
3. Détachez les cellules Ts12 et Ts14 ihOEG de la boîte de culture cellulaire p60.
   1. Ajouter 4 mL de milieu de culture DMEM/F12 (milieu basal)-FBS (sérum fœtal bovin) dans un tube conique de 15 mL. Réchauffer à 37 °C dans un bain d’eau propre.
   2. Retirez le milieu des plaques et lavez les cellules avec 1 mL de 1x PBS (phosphate-buffered saline)-EDTA (éthylène diamine tétraacétique) une fois.
   3. Ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA dans les cellules OEG et incubez pendant 3 à 5 min à 37 °C, 5 % de CO₂.
   4. Prélever les cellules à l’aide d’une pipette p1000 et les transférer dans le milieu préparé à l’étape 2.1.
   5. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
   6. Aspirez au surnageant.
   7. Ajouter 1 mL de milieu ME10 et remettre la pastille en suspension.
   8. Comptez le nombre de cellules dans un hémocytomètre.
4. Semez 80 000 cellules Ts14 ou 100 000 cellules Ts12/puits sur les lamelles dans des plaques à 24 puits dans 500 μL de milieu ME10.
5. Cellules de culture à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 24 h.

2. Dissection tissulaire rétinienne

REMARQUE : Des rats Wistar mâles de 2 mois sont utilisés comme source RGN. Deux rétines (un rat) pour 20 puits d’une boîte cellulaire de 24 puits. Autoclave du matériel chirurgical avant utilisation. Le kit de dissociation de la papaïne est acheté dans le commerce (Table des matériaux). Suivez les instructions du fournisseur pour la reconstitution. Reconstituer l’acide D, L-2-amino-5-phosphonovalérique (APV) dans un stock de 5 mM et préparer les aliquotes.

1. Le jour de l’essai, préparez les milieux suivants.
   1. Préparez une boîte de culture cellulaire p60 avec 5 mL d'EBSS (solution saline équilibrée d'Earle) froide (flacon 1 du kit de dissociation de la papaïne).
   2. Préparez une boîte de culture cellulaire p60 avec le flacon reconstitué 2 (papaïne) du kit de dissociation de la papaïne et 50 μL d’APV. Ajoutez ensuite 250 μL de flacon 3 reconstitué (DNase plus 5 μL d’APV).
   3. Dans un tube stérile, mélanger 2,7 mL de la fiole 1 avec 300 μL de la fiole 4 (inhibiteur de l’albumine-ovomucoïde de la protéase). Ajouter 150 μL de flacon 3 (DNase) plus 30 μL d’APV.
   4. Préparez 20 mL de milieu Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifiez un rat par asphyxie avec du CO₂.
3. Retirer la tête par décapitation à l’aide d’une guillotine, la placer dans une boîte de Pétri de 100 mm et vaporiser la tête avec de l’éthanol à 70 % avant de la placer dans une hotte à flux laminaire.
4. Coupez les moustaches du rat avec des ciseaux afin qu’elles n’interfèrent pas avec la manipulation oculaire.
5. Saisissez le nerf optique avec une pince pour retirer suffisamment le globe oculaire pour pouvoir faire une incision à travers l’œil avec un scalpel.
6. Retirez le cristallin et l’humeur vitrée et retirez la rétine (tissu orange) tandis que les couches restantes de l’œil (y compris la couche épithéliale pigmentaire) restent à l’intérieur.
7. Placez la rétine dans la boîte de culture cellulaire p60 préparée à l’étape 2.1.1.
8. Transférez la rétine dans la boîte de culture cellulaire p60 préparée à l’étape 2.1.2 et coupez-la avec le scalpel en petits morceaux d’environ 1 mm < la taille de la rétine.
9. Transférer dans un tube de plastique de 15 ml.
10. Incuber le tissu pendant 30 min, dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO₂, en agitant toutes les 10 min.
11. Dissociez les amas cellulaires en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
12. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.
13. Jetez le surnageant. Pour inactiver la papaïne, remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution préparée à l’étape 2.1.3 (1,5 mL pour 2 yeux).
14. Pipeter soigneusement cette suspension cellulaire dans 5 mL de flacon 4 reconstitué.
15. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
16. Pendant la centrifugation, retirez complètement le milieu ME-10 de la plaque de cellule OEG 24 puits (préalablement préparée à l’étape 1) et remplacez-le par 500 μL de milieu NB-B27 par puits.
17. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu NB-B27.
18. Plaque de 100 μL de suspension de cellules rétiniennes, par puits de la plaque m24, sur des lamelles monocouches traitées PLL ou OEG.
19. Maintenir les cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 96 h dans le milieu NB-B27.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B-27 Supplément	Gibco	17504044
Acide D,L-2-amino-5-phosphonovalérique	sigma	283967	Inhibiteur du récepteur NMDA
DMEM-F12	Gibco	11320033	Milieu de culture cellulaire
FBS	Gibco	11573397	Sérum fœtal bovin
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Sérum fœtal bovin
L-Glutamine	Lonza	BE17-605F
Milieu neurobasal	Gibco	21103049	Milieu de culture de cellules neuronales
Système de dissociation de la papaïne	Société biochimique Worthington	LK003150	Pour l’isolement des cellules neurales
Pbs	Fait maison
PBS-EDTA	Lonza	N° H3BE02-017F
Pénicilline/streptomycine/amphotéricine B	Lonza	17-745E	Bactériostatique et bactéricide
Extrait hypophysaire	Gibco	13028014	Extrait hypophysaire bovin
Poly-L-lysine (PLL)	sigma	A-003-M