Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Taches de gel de matrice extracellulaire
- Effectuez les étapes suivantes un jour avant l’isolement :
- Décongeler une aliquote de gel de matrice extracellulaire (100 μl) à 4 °C pendant au moins 1,5 h. Diluer 1:10 dans un milieu Eagle's modifié de Dulbecco, avec 4 500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamine et 110 mg/ml de pyruvate de sodium (DMEM). Maintenez le gel de matrice extracellulaire à 4 °C en tout temps.
REMARQUE : Des changements brusques de température entraîneront un revêtement inégal et la formation de cristaux.
- Conservez la solution de gel de matrice extracellulaire diluée sur de la glace pendant 15 min.
- Pré-refroidir une micropipette de 20 μl pendant 10 min.
- Placez les lames de chambre à 8 puits dans une boîte de Pétri de 100 mm et transférez la boîte sur une surface froide (par exemple un bloc réfrigérant) pendant 10 min.
- À l’aide de la micropipette pré-réfrigérée, placez une goutte de 10 μl de gel de matrice extracellulaire dans chaque puits. Conservez la boîte de Pétri sur la surface froide pendant au moins 7 minutes supplémentaires (Figure 1A).
- Retirez complètement le gel de matrice extracellulaire restant (figure 1B) et séchez les puits à 37 °C pendant la nuit.
2. Dissection des muscles de la tête (masséter, digastric et releveur du voile palatin)
- Avant la dissection, préparer 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complétée par 2 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Restez sur la glace.
- Après l’euthanasie d’un jeune rat adulte (9 semaines) avec du CO2/O2, décapitez la tête et retirez la peau de la tête. Transférer la tête dans du PBS glacé complété par 2 % de P/S dans un tube de 50 ml.
- Muscle masséter (dérivé du 1er arc branchial)
- Placez la tête avec un côté vers le haut sur un tampon en silicone et fixez-la à l’aide d’aiguilles hypodermiques (Figure 2A).
- Identifiez la glande parotide et le nerf facial (Figure 2A). Exposez le fascia profond qui recouvre la glande. Coupez le fascia et retirez le glande à l’aide de ciseaux de dissection. Identifiez le conduit auditif externe. Tracez le nerf facial à partir du foramen stylomastoïdien et retirez soigneusement les branches temporales, zygomatiques et buccales à l’aide de la lame de scalpel n° 15.
- Libérez la tête superficielle du muscle masséter en enlevant le fascia. Identifiez les têtes superficielles et profondes du muscle masséter. Tracez la tête superficielle jusqu’à ce que son aponévrose tendineuse épaisse soit insérée dans l’apophyse zygomatique du maxillaire.
- Séparez le tendon de son origine au niveau de l’apophyse zygomatique à l’aide d’une pince droite. Coupez-le à l’aide d’une lame de scalpel n° 15 ou de ciseaux de dissection et soulevez-le avec précaution (figure 2B).
- Disséquez la tête superficielle du masséter jusqu’à son insertion à l’angle et la moitié inférieure de la surface latérale de la branche de la mandibule à l’aide d’une lame de scalpel n° 15 (Figure 2C). Maintenant, retirez complètement le muscle.
- Ventre postérieur du muscle digastrique (dérivé du 2ème arc branchial)
- Placez la tête en position couchée sur le coussinet en silicone et fixez-la à l’aide d’aiguilles hypodermiques (Figure 3A).
- Retirez la graisse sous-cutanée recouvrant les glandes sublinguales et sous-mandibulaires. Ensuite, retirez le fascia superficiel et les glandes à l’aide de ciseaux de dissection. Exposer le muscle digastrique (ventre antérieur et postérieur).
- Tenez le tendon antérieur du ventre postérieur à l’aide d’une pince droite, coupez-le et disséquez-le soigneusement jusqu’à ce qu’il prenne son origine dans la bulle tympanique (Figure 3B). Faites de même du côté controlatéral.
- Muscle releveur du veli palatini (dérivé du 4e arc branchial)
- Après dissection du ventre postérieur du muscle digastrique, localisez le muscle stylohyoïde, tirez-le latéralement et retirez-le soigneusement (Figure 4A).
- Localiser le tendon du releveur du veli palatini qui s’insère au niveau de la bulle tympanique (Figure 4A). Disséquez-le soigneusement et coupez-le des deux côtés.
- Cherchez la trachée et l’œsophage qui court derrière elle. Soulevez l’œsophage et exposez le pharynx et le larynx.
- Localisez et disséquez la zone du muscle constricteur pharyngé supérieur. Identifiez le releveur du veli palatini et coupez-le des deux côtés (Figure 4B).
note: Directement après la dissection, retirez soigneusement le tendon et le tissu conjonctif de chaque muscle au stéréomicroscope. Immergez rapidement tous les échantillons dans de l’éthanol à 70 % et transférez-les dans du PBS glacé complété par 2 % de P/S dans un tube de 15 ml.
3. Isolement des cellules satellites (SC)
- Effectuez les étapes de préparation suivantes pour l’isolement du SC à partir des trois groupes musculaires :
- Préparez 7,5 ml de pronase à 0,1 % dans du DMEM. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm. Préchauffer la solution à 37 °C dans un bain-marie pendant 10 minutes avant de l’isoler.
- Préparez 35 ml de DMEM complété par 10 % de sérum de cheval (HS) et 1 % de P/S. De plus, préchauffez à 37 °C dans un bain-marie.
- Préparez un milieu de culture de 15 ml composé de DMEM complété par 20 % de sérum de veau fœtal, 10 % de HS, 1 % de P/S et 1 % d’extrait d’embryon de poulet (CEE). Préchauffer à 37 °C au bain-marie.
- Pré-enduire six pipettes en plastique (10 ml) de HS et sécher pendant au moins 10 min avant utilisation.
- Dans le capot de culture, transférez chaque muscle dans un puits d’une plaque à 6 puits. À l’aide des ciseaux de dissection, coupez le muscle en petits morceaux d’environ 2 mm. Attention à ne pas trop hacher le tissu.
- Ajouter délicatement 2,5 ml de solution de pronase à 0,1 % dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 60 min. Agiter doucement la plaque après 20, 40 et 60 min
note: La durée exacte de l’incubation dépend de facteurs tels que l’âge et la souche des animaux.
- Surveiller au microscope. Vérifiez les fragments musculaires et arrêtez la digestion enzymatique lorsque les faisceaux de fibres semblent relâchés (Figure 5).
- Ajouter 2,5 ml de DMEM complété par 10 % de HS et 1 % de P/S. Transférer dans un tube de 15 ml et centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation.
- Ajouter 5 ml de DMEM complété par 10 % de HS et 1 % de P/S. Pipeter la solution de haut en bas avec une pipette en plastique de 10 ml (trituration) au moins 20 fois pour homogénéiser le tissu.
- Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 4 min. Recueillir le surnageant et le transférer dans un tube de 15 ml.
- Ajouter 5 ml de DMEM complété par 10 % de HS et 1 % de P/S. Pipeter à nouveau avec une pipette en plastique de 10 ml jusqu’à ce que les fragments de tissu passent facilement.
- Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 4 min et recueillir le surnageant dans un tube de 15 ml.
- Placez une passoire à cellules (40 μm) sur un tube de 50 ml et transférez le surnageant contenant les cellules dissociées sur le filtre. Laver avec 1 ml de DMEM pour une récupération cellulaire maximale.
- Centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 10 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture de 300 μl et compter les cellules dans un hémocytomètre.
4. Différenciation des cellules satellites sur des taches de gel de matrice extracellulaire
- Diluer la suspension cellulaire pour obtenir 1,5 x 103 cellules dans 10 μl de milieu de culture.
- Fixez les couvercles des lames de la chambre avec du ruban adhésif et marquez les endroits avec un marqueur noir sur la face inférieure du verre de l’objet.
- À l’aide d’une micropipette, déposer une goutte de suspension cellulaire de 10 μl sur le point de gel de la matrice extracellulaire. Vérifiez au microscope si la goutte de suspension cellulaire a été correctement placée sur place. Incuber pendant six heures à 37 °C.
- Ajouter délicatement 400 μl de milieu de culture (DMEM complété par 20 % de FBS, 10 % de HS, 1 % de P/S et 1 % de CEE) et incuber pendant trois jours à 37 °C
note: À ce stade, les cellules souches embryonnaires fraîchement isolées sont soumises à un traumatisme massif (digestion enzymatique et trituration sévère) et elles doivent se rétablir. Ne dérangez pas les cellules pendant les trois premiers jours. Ensuite, le milieu de culture peut être modifié en fonction du type d’expérience.
Les taches de gel de matrice extracellulaire peuvent être ensemencées avec une densité cellulaire élevée (1,5-2,5 x 103/20 μl) pour le test de différenciation. Le milieu de culture (DMEM complété par 20 % de FBS, 10 % de HS, 1 % de P/S et 1 % d’extrait d’embryon de poulet) peut être remplacé tous les trois jours.
