Neurogenèse induite par l’acide rétinoïque à l’aide de cellules de carcinome embryonnaire de souris

Résumé

Source : Leszczyński, P., et al., Neurogenèse à l’aide de cellules de carcinome embryonnaire P19 J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente une technique simple de neurogenèse induite par l’acide rétinoïque dans les cellules de carcinome embryonnaire de souris P19. L’acide rétinoïque active les facteurs de transcription et déclenche l’expression des gènes pour la différenciation neuronale.

Protocole

1. Génération d’agrégats

1. Ajouter 5 μL de RA (acide rétinoïque) (1 mM de pâte dissoute dans de l’éthanol à 99,8 %, stocké à -20 °C) aux 10 mL de milieu de différenciation et bien mélanger (concentration finale de 0,5 μM de RA).
   note: La PR est sensible à la lumière. Une faible concentration d’éthanol n’affecte pas la différenciation cellulaire.
2. Ajouter 10 mL de milieu de différenciation (avec AR) dans la boîte de culture non traitée de 100 mm (dédiée à la culture en suspension).
3. Ensemencez les 1 x 10⁶ cellules dans la boîte de 100 mm (surface de la boîte 56,5 cm2).
4. Placez le ballon avec les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 2 jours pour favoriser la formation d’agrégats.
5. Après 2 jours, remplacez le milieu de différenciation. Aspirer un milieu contenant des agrégats à l’aide d’une pipette de 10 mL et transférer dans un tube de 15 mL à RT.
6. Laisser les agrégats se déposer par gravité pendant 1,5 min à RT.
7. Jetez le surnageant.
8. Ajouter 10 ml de milieu de différenciation frais avec 0,5 μM d’AR à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
   prudence: Ne pipetez pas les agrégats de cellules de haut en bas.
9. Semez les granulats dans une nouvelle boîte de culture non traitée de 100 mm (dédiée à la culture en suspension).
10. Placez la plaque dans l’incubateur (à 37 °C et 5 % de CO₂) pendant 2 jours.

2. Dissociation des agrégats

1. Aspirer les agrégats de cellules à l’aide d’une pipette de 10 ml.
2. Transférez les agrégats dans un tube de 15 ml. Laissez les agrégats cellulaires se déposer par gravité pendant 1,5 min.
3. Retirez le surnageant.
4. Lavez les agrégats avec du DMEM seul (sans sérum ni antibiotiques).
5. Laisser les agrégats cellulaires se déposer par sédimentation gravitaire pendant 1,5 min à RT.
6. Aspirer le surnageant et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA (0,25 %).
7. Placez les agrégats cellulaires dans un bain-marie (37 °C) pendant 10 min. Agitez doucement les agrégats toutes les 2 minutes en tapotant avec la main.
8. Arrêtez le processus de trypsinisation en ajoutant 4 mL de milieu d’entretien.
9. Pipetez les agrégats de haut en bas 20 fois à l’aide d’une pipette de 1 ml.
10. Cellules de centrifugation pendant 5 min à 200 x g et RT.
11. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de milieu d’entretien.
12. Déterminez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.

3. Cellules de placage

1. Ajouter 3 ml par puits de milieu d’entretien dans une assiette à 6 puits.
2. Cellules d’ensemencement dans la plaque de culture à 6 puits à une densité de 0,5 x 10⁶/puits.
3. Incuber à 37 °C avec une concentration de 5 % de CO₂.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM hyperglycémique (4,5 g/L) avec L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Éthanol 99,8 %	Chempur	CHIMIE*613964202
Sérum fœtal bovin (FBS)	L’eurosx	Référence E5050-03
Pénicilline/Streptomycine 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x concentrée sans ions calcium et magnésium	Lonza	BE17- 517Q
Acide rétinoïque	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	Dissous dans de l’éthanol à 99,8 % ; se conserve à -20 °C jusqu’à 6 mois
Trypsine 0,25 % - EDTA dans HBSS, sans ions calcium et magnésium, avec rouge de phénol	Biosérums	LM-T1720/500
Pipettes sérologiques de 1 mL	Profilab	Référence 515.01
Pipettes sérologiques de 10 mL	Profilab	515.1
Plat de 100 mm dédié à la culture en suspension	Corning	C351029
Tubes à centrifuger de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipettes sérologiques de 5 mL	Profilab	Référence 515.05
Plaque à 6 puits	Corning	CLS3516
Fioles de culture cellulaire, surface 25 cm carré	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA