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1. Culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
- Préparez le milieu MEF, le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, high-glucose), complété par 15 % de sérum bovin fœtal (FBS).
- Enduire des boîtes de culture cellulaire de 100 mm d’une solution de gélatine à 0,5 % pendant 30 min à température ambiante (RT).
- Comptez les MEF à l’aide d’un cytomètre. Retirer la solution de gélatine et verser immédiatement le MEF préchauffé à 37 °C. Décongeler rapidement les flacons de MEF traités à la mitomycine C dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min, puis ensemencer 2,8 x 106 MEF par plat de 100 mm recouvert de gélatine. Ajustez le numéro de cellule en conséquence si vous utilisez des plats d’autres tailles. Incuber les MEF pendant la nuit à 37 °C, 5 % CO2.
- Changez de support le lendemain. Cultiver pendant 2-3 jours jusqu’à ce que la couche MEF soit confluente.
2. Culture de cellules souches embryonnaires de souris ou ESC
- Préparez le milieu ESC, le milieu Dulbecco modifié (IMDM) d'Iscove complété par 15 % de FBS et 10 facteurs inhibiteurs de leucémie (LIF)de 3 U/mL, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 55 mM de 2-mercaptoéthanol, de la pénicilline (100 U/mL), de la streptomycine (100 μg/mL), de la gentamicine (200 μg/mL) et de l'antibiotique mycoplasme à 0,2 %.
- Retirez le milieu MEF du plat préparé à l’étape 1 et remplacez-le par un milieu ESC préchauffé à 37 °C.
- Dégivrez un flacon ESC et des cellules d’amorçage sur la couche MEF. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2, jusqu’à ce que les ESC atteignent leur confluence.
- Préparez de nouvelles boîtes de culture cellulaire contenant une monocouche confluente de MEF. Pour passer les ESC, laver une fois avec du PBS et détacher avec 0,25 % de trypsine/EDTA pendant 2 à 5 min à 37 °C, 5 % de CO2. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant de l’IMDM frais avec 15 % de FBS aux cellules qui se détachent, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifugez à 160 x g pendant 5 min à RT.
- Retirez le surnageant, remettez en suspension les ESC avec de l’IMDM frais et faites passer un cinquième des cellules dans chaque nouvelle boîte recouverte de MEF ; incubez jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence (généralement 4 à 5 jours).
3. Retrait des MEF et culture des ESC sur des plaques recouvertes de gélatine
- Une fois que les ECS atteignent la confluence, détachez-les et les MEF avec 0,25 % de trypsine/EDTA comme à l’étape 2.4, remettez les cellules en suspension dans de l’IMDM frais, transférez-les dans une boîte de Pétri bactériologique non adhésive et incubez pendant 40 min à 37 °C, 5 % de CO2.
- Transférez avec précaution le fluide contenant des ESC et des MEF sur une nouvelle plaque recouverte de gélatine à l’aide d’une pipette de 5 ml, en évitant les pipetages répétés. Les cellules restantes dans les boîtes de Pétri sont des MEF car les ESC n’y adhèrent pas.
- Passage des ESC tous les 3-4 jours. Des passages moins fréquents peuvent réduire la pluripotence des ESC. Ne dépassez pas 60 % de confluence, car cela peut favoriser la différenciation.
- Répétez les étapes 3.2 et 3.3 trois fois ou plus, au besoin, jusqu’à ce que les MEF ne soient plus détectables par un microscope de culture cellulaire, à l’aide d’un objectif 20X, pour s’assurer qu’il n’y a pas de MEF.
- Vérifiez la pluripotence de l’ESC en vérifiant la culture de l’ESC pour voir si les cellules forment des colonies denses avec une morphologie polygonale typique de l’ESC (Figure 1A). Testez la souche cellulaire par réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse quantitative (qRT-PCR), immunotransfert ou immunofluorescence des facteurs de transcription de pluripotence de base (Figure 2).
4. Formation EB
- Préparer une solution mère tout-trans-RA à 10 mM dans du DMSO et l’aliquote dans des tubes de microfuge de 1,5 mL protégés contre la lumière. La solution est stable à -80 °C jusqu’à deux semaines. Protégez-le de la lumière.
- Trypsiniser les ESC comme à l’étape 2.4 ; replaquer dans de l’IMDM frais sans LIF en suspension unicellulaire.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparer une suspension de 5 x 105 cellules/mL dans de l’IMDM avec 0,5 μM d’AR.
- Plaquez 100 gouttes de 20 μL par boîte de Pétri de 100 mm à l’aide d’une pipette à 8 canaux et d’embouts de 200 μL, retournez les plats et remplissez le couvercle inversé de PBS pour éviter que les gouttes suspendues ne sèchent. Protégez les milieux de culture contenant de l’AR de la lumière.
- Cultiver les EB en gouttes suspendues à 37 °C, 5 % CO2, pendant 4 jours.
