1. Clonage du lentivecteur 2K7
- Avant de cloner le gène d’intérêt dans le vecteur lentiviral 2K7, sous-clonez le gène dans le vecteur pENTR (3637 pb, résistant à la kanamycine) à l’aide de techniques moléculaires standard. Utilisez les sites de restriction EcoRI et SacII pour le sous-clonage.
- Amplification du lentivecteur 2K7
- Transformez l’ADN du lentivecteur 2K7 en mélangeant doucement 100 ng d’ADN plasmidique avec des cellules compétentes, et incubez sur glace pendant 30 min.
- L’ADN de choc thermique/les cellules compétentes se mélangent à 42 °C pendant 90 secondes et les plaquent sur des plaques LB-Agar contenant à la fois de l’ampicilline (100 μg/ml) et du chloramphénicol (15 μg/ml) à 37 °C pendant 16-18 heures
REMARQUE : Le chloramphénicol est utilisé pour empêcher la recombinaison entre les longues répétitions terminales.
- Le lendemain, cultivez des clones bactériens sélectionnés dans un milieu Luria-Bertani (LB) contenant à la fois de l'ampicilline (100 μg/ml) et du chloramphénicol (15 μg/ml) à 37 °C pendant 16 à 18 h. Extrayez l'ADN à l'aide d'un kit d'ADN plasmidique commercial Maxiprep selon les instructions du fabricant.
- Sous-clonage du vecteur pENTR vers le lentivecteur 2K7 (Figure 1).
- Ajouter les éléments suivants dans un tube de 1,5 ml et mélanger délicatement : L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promoteur) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (avec gène d’intérêt) (80 bng)1-2,5 μl Lentivecteur K7 (80 ng/μl)1 μl tampon TE, pH 82-5 μl.Total 8 μl.
- Retirer le mélange d’enzymes clonases à -80 °C et le décongeler sur de la glace pendant 2 min. S’assurer que cette enzyme est une aliquote fraîche à partir de -80 °C, car l’efficacité du clonage de l’enzyme est considérablement réduite avec des cycles de congélation-décongélation répétés.
- Ajouter 2 μl d’enzyme par réaction et bien mélanger par vortex, puis incuber le mélange réactionnel de clonase à 23-25 °C pendant 6-24 heures.
- Ajouter 1 μl de solution de protéinase K (fournie avec le kit enzymatique) au mélange réactionnel de clonase et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Transformez le mélange réactionnel de clonase en cellules compétentes et cultivez les colonies sélectionnées dans un milieu LB contenant de l’ampicilline (100 μg/ml) à 37 °C pendant 16 à 18 heures.
- Extrayez et purifiez l'ADN à l'aide d'un kit commercial de mini-préparation d'ADN plasmidique selon les instructions du fabricant.
- Confirmer l'ADN par digestion à l'aide des enzymes de restriction Spe I et Sac II et d'un tampon approprié conformément aux instructions du fabricant pour éliminer le fragment contenant le promoteur et le gène d'intérêt.
REMARQUE : Cette étape est essentielle pour vérifier si l’ADN sous-cloné possède le bon gène d’insertion d’intérêt avec le squelette vectoriel droit. La taille du vecteur lui-même sans le fragment inséré est de 6,7 kb. La taille du fragment inséré libéré comprend à la fois le promoteur et le gène d’insertion d’intérêt. Calculez les tailles de fragments attendues à partir de la digestion pour le gène spécifique via un programme d’édition de séquences d’ADN, par exemple, APE-A Plasmid Editor.
- Vérifiez la taille du squelette du vecteur d’ADN et du fragment libéré en analysant un gel d’agarose à 1 % dans 1 tampon TAE (voir le tableau 1) à 100 V.
- Amplifiez l’ADN confirmé en cultivant des bactéries dans 500 ml de milieu LB contenant de l’ampicilline (100 μg/ml) à 37 °C pendant 16 à 18 heures.
- Extrayez et purifiez l'ADN à l'aide d'un kit d'ADN plasmidique commercial Maxiprep selon les instructions du fabricant.
note: Maxiprep génère généralement une quantité suffisante d’ADN nécessaire à la production virale.
- Répétez les étapes 1.3.9 et 1.3.10 pour amplifier les ADN suivants pour les préparations lentivirales : Vecteur enveloppe (PMD2. G, 6,1 kb), vecteur de paquet (pBR8.91, 12,5 kb) et un vecteur lentiviral vide comme témoin (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).
2. Production de virus 2K7
REMARQUE : Jour 1 :
- Le jour de la transfection, mettre en boîte 32 millions de lymphocytes T HEK293 dans une fiole T175 contenant 25 ml de milieu de cellules T de rein embryonnaire humain (HEK) 293 (voir tableau 1). Alternativement, plaquez 16 millions de cellules la veille de la transfection si le temps presse le jour de la transfection.
note: La transfection peut être tout aussi réussie en plaquant les cellules le jour de la transfection ou avant le jour. En utilisant l’une ou l’autre des deux alternatives, le point critique ici est de s’assurer que les cellules sont collées à la surface de la boîte de culture avant la transfection.
note: Jour 2 :
- transfection
- Avant la transfection, diluer l’ADN à 1 μg/μl dans un tampon d’acide tris-éthylènediaminetétraacétique (TE) contenant 10 mM de Tris pH 8, 1 mM d’EDTA pH 8 dans de l’eau déminéralisée.
- Dans un tube de 50 ml, préparer un mélange maître (tableau 2) pour la transfection dans la fiole T175. Ajouter de l'ADN dans du milieu modifié de Dulbecco (DMEM) préchauffé et bien mélanger par vortex, puis ajouter de la polyéthylèneimine stérile (PEI) (voir le tableau 1 pour éviter les précipitations prématurées.
- Bien mélanger en inversant le tube 3-4x, et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Effectuez un changement complet de média sur HEK293T cellules. Aspirer complètement le milieu de culture des cellules et nourrir avec du milieu de culture cellulaire HEK293T préchauffé (25 ml par fiole T175).
- Ajouter le mélange de transfection (mélange ADN/PEI) goutte à goutte sur les cellules monocouches. Agitez doucement pour bien mélanger et incubez les cellules transfectées à 37 °C, 5 % de CO2, pendant la nuit.
REMARQUE : Jour 3 :
- Pour vous assurer que la transfection est réussie, vérifiez l’expression de la protéine de fluorescence verte (GFP) 24 heures après la transfection par microscopie fluorescente.
note: Plus de 50 % des cellules exprimant la GFP indiquent généralement une bonne transfection.
note: Jour 4 :
- 48 heures après la transfection, prélever le surnageant viral et le remplacer par un milieu frais HEK293 T (25 ml par fiole T175).
- Centrifuger le surnageant viral à 1 140 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires du surnageant. Transvaser le surnageant éliminé dans un tube de 50 ml et le conserver à 4 °C
REMARQUE : Jour 5 :
- 72 heures après la transfection, prélever le deuxième lot de surnageant viral. Répétez l’étape 2.3.1 et accumulez les surnageants éliminés pendant 48 et 72 heures.
- Pour concentrer le virus, centrifuger le surnageant viral à 170 000 x g pendant 90 min à 4 °C à l’aide de tubes d’ultracentrifugation de 30 ml.
- Jeter le surnageant et répéter l’étape 2.6 jusqu’à ce que tout le surnageant éliminé ait été centrifugé, laissant une pastille (invisible) de virus et d’IPE précipité dans la base du tube.
- Pour remettre le virus en suspension, ajoutez 500 μl de support SATO (voir tableau 1) dans les tubes de l’ultracentrifugeuse. Agitez pendant 30 secondes et raclez la base du tube avec la pointe d’une pipette pour détacher mécaniquement le virus. Répétez cette étape 6 fois afin de perdre la pastille virale.
- Mettez le virus en suspension dans des tubes de microcentrifugation et faites-le tourner très brièvement pour éliminer le PEI insoluble. Filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm pour éliminer les protéines.
- Aliquote le virus en aliquotes de 20 μl, 50 μl et 100 μl et stockez-le à -80 °C.
3. Transduction des OPC
- Cultiver des OPC primaires dans un milieu SATO (plaque de 10 ml/10 cm) avec le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF, 10 ng/ml), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF, 10 ng/ml), la neurotrophine 3 (NT3, 1 ng/ml) et la forskoline (4,2 μg/ml) à 37 °C, 8 % de CO2 pendant 24 heures après la dissection.
- Aspirez complètement le milieu de culture OPC et nourrissez les cellules avec du milieu SATO fraîchement préparé (10 ml) avec des facteurs de croissance (voir ci-dessus à l’étape 3.1).
- Ajouter le virus aux OPC à la concentration optimale, cultiver les OPC pendant 48 heures supplémentaires.
4. Ensemencement OPC pour les co-cultures myélinisantes (Figure 2)
- Pour éliminer les OPC de la surface, rincez d'abord deux fois les plaques d'OPC avec 8 ml de solution saline équilibrée d'Earle (EBSS), puis incubez les cellules avec 5 ml de trypsine-EDTA tiède à 0,05 % diluée 1:10 avec EBSS à 37 °C pendant 2 min.
- Neutraliser la trypsine avec 30 % de FBS dans EBSS (5 ml) et prélever les cellules de la plaque par pipetage. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifugez à 180 x g pendant 15 min à RT.
- Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 ml de milieu SATO préchauffé, puis numération des cellules.
- Avant l’ensemencement de l’OPC, aspirer complètement le milieu de la plaque de culture DRG. Ensemencez doucement 200 000 OPC goutte à goutte sur les neurones DRG comme décrit précédemment.
note: Le volume total de semis OPC doit être inférieur à 200 μl par lamelle de 22 mm.
- Laissez les cellules se déposer sans déplacer la plaque pendant 10 min dans le capot de culture tissulaire, puis complétez doucement avec 1 ml de milieu SATO préchauffé par puits.
- Replaquez les OPC frères restants avec un média SATO avec des facteurs de croissance (voir étape 6.1). Utilisez ces OPC sœurs pour vérifier l’expression de la protéine d’intérêt.
- Après 24 heures, remplacez le milieu SATO par le milieu de co-culture (2 ml/puits) contenant le milieu SATO (aucun facteur) et le milieu neurobasal (v/v) avec 1 % de B2Maintenez les co-cultures pendant 14 jours avec changement de milieu tous les 2-3 jours.
- Évaluer les co-cultures pour l’expression de la protéine de myéline par analyse par transfert Western et visualiser la formation de segments axonaux myélinisés par double immunomarquage avec des anticorps contre les marqueurs de la protéine basique de la myéline et les marqueurs neuronaux.
